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AM真菌孢子萌发及其与紫云英转化根双重培养体系建立的研究

作　者: 曹玲
导　师: 赵斌
学　校: 华中农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 转化根 AM真菌双重培养发根农杆菌
分类号: S551.9
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

丛枝菌根(AM)在自然界中广泛分布,能够与自然生态系统中80%以上的维管属植物共生,形成丛枝菌根。AM真菌能够促进宿主植物矿质营养吸收,增强抗逆抗病能力,对维持陆生生态系统及植物多样性有重要作用。由于AM真菌具有专性共生的特性,离体纯培养至今尚未实现。因此,AM真菌的单菌培养是40余年来人们一直探索的关键技术,也是AM真菌研究的重点和热点。世界各国都在积极开展AM真菌单菌培养的研究工作。本论文研究了在离体培养条件下培养基质、金属离子等环境因素对AM真菌孢子萌发和芽管菌丝生长发育的影响；利用发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)转化的豆科植物紫云英Ri T-DNA转化根与AM真菌Glomus intraradices、Gigaspora margarita、Gigaspora rosea建立了双重培养体系。该双重培养体系是研究AM真菌形态学、生理学、生物与非生物胁迫应答、根际生物(PGPR、病原菌、线虫)相互作用、分类系统进化等方面的理想模式,更是目前公认的唯一能够提供纯净AM真菌材料的方法。采用此双重培养体系能够进行AM真菌与豆科植物相互识别信号和共生机制的研究。同时此双重培养体系也为构建AM真菌、豆科植物与根瘤菌离体三重培养体系提供了一些借鉴。论文取得主要结果如下：Gig. margarita、G. intraradices孢子在水琼脂、MSR、M、MS培养基上均能萌发,以水琼脂上萌发及菌丝生长状况最好。低浓度Zn2+、La3+促进Gig. margarita、Glomus intraradices孢子萌发,随浓度上升,孢子萌发及菌丝生长受抑制。以发根农杆菌k599转化划伤处理的大豆子叶,并获得大豆转化根,但其不能在低离子浓度的人工培养基上生长,故没有用其与AM真菌构建双重培养体系。以发根农杆菌k599转化紫云英下胚轴,研究不同卡那霉素浓度对转化根诱导率的影响,其结果为：适当的Km浓度(40μg/ml)会提高紫云英Ri T-DNA转化根形成的效率,而过高的Km浓度(60μg/ml)抑制转化根形成。在MSR培养基上尝试以Gig. margarita、Gig. rosea、Glomus intraradices建立双重培养体系,且三菌种均与紫云英转化根成功建立双重培养体系。但是巨孢囊霉属的Gig. rosea未能产生新生孢子。原因可能是巨孢囊霉属的菌种侵染宿主后菌丝生长存在迟滞期,而次生孢子的产生又受到外生菌丝生物量及辅助细胞数量的影响。

全文目录

摘要  7-8
Abstract  8-10
缩略词表  10-11
第一章文献综述  11-22
  1.1 丛枝菌根  11-15
    1.1.1 丛枝菌根简介  11
    1.1.2 丛枝菌根结构  11-13
    1.1.3 丛枝菌根真菌生活史  13
    1.1.4 丛枝菌根功能  13-15
  1.2 AM真菌培养方法  15-19
    1.2.1 活体培养  15-16
    1.2.2 离体纯培养  16-17
    1.2.3 离体双重培养  17-19
  1.3 发根农杆菌介导的遗传转化  19-20
    1.3.1 发根农杆菌转化植物研究现状  19
    1.3.2 发根农杆菌特性  19
    1.3.3 发根农杆菌基因转化的方法  19-20
    1.3.4 Ri质粒基因转化的影响因素  20
  1.4 研究目的和意义  20-22
第二章培养基质对孢子萌发影响  22-29
  2.1 引言  22
  2.2 材料与方法  22-27
    2.2.1 材料  22-25
      2.2.1.1 培养基及试剂  22-25
      2.2.1.2 供试菌种  25
    2.2.2 方法  25-27
  2.3 结果与分析  27-28
    2.3.1 培养基质对孢子萌发率的影响  27-28
    2.3.2 培养基质对孢子萌发率和菌丝生长的影响  28
  2.4 讨论  28-29
第三章重金属对孢子萌发的影响  29-35
  3.1 引言  29
  3.2 材料与方法  29-30
    3.2.1 材料  29
    3.2.2 方法  29-30
  3.3 结果与分析  30-34
    3.3.1 Zn~(2+)对孢子萌发率的影响  30-31
    3.3.2 Zn~(2+)对孢子菌丝生长影响  31-32
    3.3.3 La~(3+)对孢子萌发的影响  32-33
    3.3.4 La~(3+)对AM真菌芽管菌丝生长的影响  33-34
  3.4 讨论  34-35
第四章离体条件下AM真菌芽管的发育  35-39
  4.1 引言  35
  4.2 材料与方法  35-36
    4.2.1 材料  35-36
    4.2.2 方法  36
  4.3 结果与分析  36-37
    4.3.1 SDH酶活染色  36-37
    4.3.2 菌丝形成隔  37
    4.3.3 分枝吸收结构(BAS)  37
  4.4 讨论  37-39
第五章转化根的诱导及G. intraradices双重培养体系建立  39-48
  5.1 引言  39
  5.2 材料与方法  39-43
    5.2.1 材料  39-40
      5.2.1.1 生物材料  39-40
      5.2.1.2 培养基及试剂  40
      5.2.1.3 主要仪器  40
    5.2.2 方法  40-43
      5.2.2.1 活化菌株  40-41
      5.2.2.2 植物材料准备  41
      5.2.2.3 发根农杆菌转化植物材料  41
      5.2.2.4 转化根鉴定  41-42
      5.2.2.5 转化根培养  42
      5.2.2.6 紫云英转化根与G. intraradices双重培养体系建立  42-43
  5.3 结果与分析  43-46
    5.3.1 Km对紫云英转化根筛选的影响  43-44
    5.3.2 转化根检测  44-45
      5.3.2.1 GUS染色检测  44
      5.3.2.2 转化根rol C基因PCR扩增检测  44-45
    5.3.3 紫云英转化根生长状况  45
    5.3.4 G. intraradices的萌发状况及对紫云英转化根的侵染  45-46
  5.4 讨论  46-48
第六章转化根与Gig. margarita、Gig. rosea双重培养体系建立  48-54
  6.1 材料与方法  48-49
    6.1.1 材料  48
    6.1.2 方法  48-49
  6.2 结果与分析  49-52
    6.2.1 Gig. margarita、Gig. rosea萌发及菌丝生长状况  49-51
    6.2.2 Gig. margarita、Gig. rosea对紫云英转化根的侵染  51-52
  6.3 讨论  52-54
参考文献  54-61
致谢  61

AM真菌孢子萌发及其与紫云英转化根双重培养体系建立的研究

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