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马铃薯甲虫对4种新烟碱类杀虫剂的敏感性变化及其机理

作　者: 刘萍
导　师: 李国清
学　校: 南京农业大学
专　业: 农业昆虫与害虫防治
关键词: 马铃薯甲虫新烟碱类杀虫剂敏感性增效剂细胞色素P450 烟碱型乙酰胆碱受体
分类号: S435.32
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

马铃薯甲虫Leptinotarsa decemlineata (Say)起源于美国西南和墨西哥,现扩散到北美洲、欧洲和亚洲的大部分国家,成为马铃薯上最重要的食叶害虫。在我国,马铃薯甲虫现分布于新疆维吾尔自治区北疆,包括乌鲁木齐市、奇台和吉木萨尔县和木垒哈萨克自治县。在新疆,马铃薯甲虫为害马铃薯和茄子。化学防治是新疆治理马铃薯甲虫的常用方法,而这可能引起抗药性。因此,评估马铃薯甲虫对新烟碱类药剂的敏感性差异,研究其分子机理,对综合治理十分必要。采用点滴法于2009和2010年监测了新疆维吾尔自治区北疆9个田间种群对新烟碱类杀虫剂吡虫啉、啶虫脒、噻虫嗪和噻虫啉的敏感性变化。发现田间种群对吡虫啉和噻虫嗪的敏感性逐年降低。2009年监测了6个田间种群,3种群对啶虫脒和噻虫嗪低抗；2010年监测的6个田间种群全部对噻虫嗪产生了抗性,中抗和低抗种群各3个。在监测的2个田间种群中,1个对啶虫脒低抗。噻虫嗪可能与三氟氯氰菊酯存在交互抗性。4龄幼虫对新烟碱类农药尚敏感,且与常规药剂没有交互抗性。测定了胡椒基丁醚(PBO)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)和磷酸三苯酯(TPP)对马铃薯甲虫成虫和4龄幼虫代谢新烟碱类农药的抑制作用,发现PBO、DEM和TPP在尼勒克、乌鲁木齐和奇台种群4龄幼虫中对吡虫啉的毒杀活性具有明显的增效作用。PBO、DEM和TPP在奇台和乌鲁木齐种群4龄幼虫中对噻虫嗪的毒杀活性均没有明显的增效作用。PBO在察布查尔成虫中对吡虫啉的毒杀活性有明显增效作用；DEM和TPP在奇台种群成虫中对噻虫嗪的毒杀活性具有明显的增效作用。以上结果表明多功能氧化酶、谷胱甘肽转移酶和酯酶均参与了马铃薯甲虫对新烟碱类的代谢,其作用大小随虫态及抗药性差异不同而不同。应用马铃薯甲虫P450转录组序列,进行克隆验证,共得到34条序列,鉴定出32个细胞色素基因。这为新烟碱类农药代谢机理的研究奠定了基础。应用PCR技术,克隆出烟碱型乙酰胆碱受体α亚基序列共9条,在NCBI网络数据库中通过blast比对,得出其分别属于nAchRa 3、4、5、7、9、10亚基。应用RACE技术对其中一条较长的nAchRa亚基进行了全长克隆,cDNA序列共1378bp,其开放阅读框从25—1368位点,长度1344 bp,编码448个氨基酸。该基因具有nAchRa亚基的典型结构相邻的两个半胱氨酸(Loop C环中),并根据该基因编码的氨基酸序列与其他昆虫的nAchRa亚基的相似性,命名为nAchRα10。

全文目录

摘要 7-9ABSTRACT 9-11第一章文献综述 11-33 1 马铃薯甲虫在国内外的发生危害 11-12 1.1 马铃薯甲虫在国外发生危害 11 1.2 马铃薯甲虫在国内新疆发生危害 11-12 2 马铃薯甲虫抗药性的发展现状 12-26 2.1 国外马铃薯甲虫的抗药性研究进展 12-20 2.1.1 马铃薯甲虫对有机氯杀虫剂的抗药性 13-14 2.1.2 马铃薯甲虫对有机磷类农药的抗药性 14-16 2.1.3 马铃薯甲虫对氨基甲酸酯类农药的抗药性 16-17 2.1.4 马铃薯甲虫对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗药性 17-20 2.2 国内马铃薯甲虫的抗药性研究进展 20-23 2.2.1 马铃薯甲虫相对敏感品系的筛选 21-22 2.2.2 诊断剂量法监测马铃薯甲虫的抗性水平 22-23 2.2.3 毒力回归线法测定马铃薯甲虫的抗药性 23 2.3 马铃薯甲虫对新烟碱类杀虫剂的抗药性 23-26 3 马铃薯甲虫的抗性机理 26-31 3.1 行为抗性 26 3.2 穿透抗性 26-27 3.3 代谢抗性 27-29 3.3.1 细胞色素P450氧化酶(P450) 27-29 3.3.2 酯酶(EST) 29 3.3.3 谷胱甘肽-S-转移酶(GSTs) 29 3.4 靶标抗性 29-31 4 本研究的立题背景和意义 31-33第二章新疆北疆马铃薯甲虫对新烟碱类杀虫剂的敏感性变化 33-45 1 材料与方法 33-35 1.1 试虫 33-34 1.2 供试原药 34 1.3 毒力测定方法 34-35 2 结果与分析 35-43 2.1 马铃薯甲虫成虫的田间监测结果 35-38 2.1.1 马铃薯甲虫成虫田间种群的敏感性差异 35-37 2.1.2 马铃薯甲虫对新烟碱类杀虫剂的交互抗性 37-38 2.2 马铃薯甲虫4龄幼虫的田间监测结果 38-43 2.2.1 马铃薯甲虫4龄幼虫田间种群的敏感性差异 38-41 2.2.2 四种新烟碱药剂的相对毒力比较 41 2.2.3 四种新烟碱类杀虫剂LD_(50)值差异与常用药剂抗性的相关性 41-43 3 讨论 43-45第三章马铃薯甲虫代谢新烟碱类杀虫剂的途径 45-51 1 材料与方法 46 1.1 试虫 46 1.2 供试药剂与用具 46 1.3 实验方法 46 2 结果与分析 46-50 2.1 三种酶抑制剂对4龄幼虫代谢吡虫啉和噻虫嗪的影响 46-48 2.2 三种酶抑制剂对成虫代谢吡虫啉和噻虫嗪的影响 48-50 3 讨论 50-51第四章马铃薯甲虫P450的克隆验证、序列分析 51-63 1 材料与方法 51-58 1.1 试虫 51 1.2 主要试剂和仪器 51-52 1.3 PCR 52-58 1.3.1 总RNA的提取 52 1.3.2 cDNA第一链的合成 52-53 1.3.3 PCR引物设计 53-55 1.3.4 PCR扩增体系及条件 55-56 1.3.5 PCR产物回收与纯化 56-57 1.3.6 连接及转化 57 1.3.7 重组质粒的提取及检测 57-58 1.3.8 序列测定与分析 58 2 结果与分析 58-61 3 讨论 61-63第五章马铃薯甲虫烟碱型乙酰胆碱受体的克隆验证与序列分析 63-71 1 材料与方法 63-66 1.1 试虫 63 1.2 主要试剂和仪器 63-64 1.3 实验操作步骤 64-66 1.3.1 PCR引物设计 64-65 1.3.2 RACE cDNA第一链的合成 65 1.3.3 RACE引物设计 65 1.3.4 RACE扩增体系及条件 65-66 1.3.5 序列分析与系统发育树的构建 66 2 结果及分析 66-71 2.1 马铃薯甲虫nAchR基因克隆与验证 66-67 2.2 马铃薯甲虫nAchRα10基因全长的克隆和序列分析 67-68 2.3 系统进化树的构建 68-70 3 讨论 70-71参考文献 71-87附录一克隆证实的马铃薯甲虫P450基因详情 87-95附录二克隆证实的马铃薯甲虫NACHR基因详情 95-97攻读硕士学位期间发表的论文 97-99致谢 99-100

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