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碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源暴式集落形成细胞形成的作用及其机制研究

作　者: 李娜
导　师: 石增立；王跃嗣
学　校: 滨州医学院
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 集落形成细胞碱性成纤维细胞生长因子小鼠胚胎干细胞 Wnt Shh
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

目的:在拟胚体培养阶段施加碱性成纤维细胞生长因子,验证碱性成纤维细胞生长因子对暴式集落形成细胞产生的调控作用及探讨其作用机制。方法:1.购买小鼠胚胎干细胞D3细胞系,取第3-5代小鼠原代胚胎成纤维细胞,加入新配制含丝裂霉素C的DMEM生长培养基孵育2.5 h,使饲养层细胞失去增殖能力;加入胰酶消化适度,离心后制成单细胞悬液,以10×10~4个/cm~2的密度种至用明胶包被的培养瓶中,放入孵箱内培养24 h之后使用。复苏胚胎干细胞D3细胞并将其接种于饲养层细胞之上。培养至一定时期后传代并及时冻存。2.在拟胚体培养阶段按培养基成分不同分为4组:对照组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子组)、5μg/L bFGF组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+5μg/L bFGF组)、10μg/L bFGF组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+10μg/L bFGF组)、15μg/L bFGF组(标准培养基+血管内皮生长因子+干细胞因子+15μg/L bFGF组)。各组于培养3、4、5、6d时分别计数克隆形成数,通过免疫荧光法及IMAGE-PRO PLUS图像分析系统检测集落形成细胞Flk-1的表达情况,以此来筛选其最佳作用浓度。3.通过免疫荧光法检测集落形成细胞相关表面标志(Flk-1、CD133、CD34)的表达情况。4.通过免疫荧光法检测相关通路的受体表达情况,通过RT-PCR法检测相关信号通路特异性靶基因(Axin2、Gli)的表达情况,从而来进一步探讨bFGF发挥作用的相关机制。结果:1.成功制备小鼠的胚胎成纤维细胞;2.扩增并冻存大量的胚胎干细胞,并证明扩增的胚胎干细胞具有全能性;3.培养体系中加入bFGF后,有大量克隆形成,克隆Flk-1呈阳性表达,不同的浓度梯度克隆形成数量不同,且Flk-1的表达强度不同,其中10μg/L bFGF组克隆形成数量最多且Flk-1的表达最强(P < 0.01);3.在BL-CFC生成过程中,Flk-1逐渐减弱,而CD133,CD34的表达逐渐增强;4.在BL-CFC形成过程中,Wnt, Shh信号通路的表面受体表达逐渐增强,其Wnt通路的特异性靶基因(Axin2)的表达也逐渐增强。结论:1.成功制备小鼠的胚胎成纤维细胞,扩增并冻存了大量的胚胎干细胞;2. bFGF促进了BL-CFC的形成,其最佳浓度为10μg/L;3.形成的BL-CFC能够向造血干/祖细胞方向分化;4.在BL-CFC形成过程中,Wnt, Shh信号通路的表面受体表达逐渐增强,Wnt通路的特异性靶基因(Axin2)的表达也逐渐增强,初步证明bFGF促进了BL-CFC的形成的作用机制与Wnt通路的激活相关。

全文目录

中文摘要  6-8
Abstract  8-10
英语缩略语  10-11
前言  11-14
主要仪器及设备  14-15
主要试剂及配制  15-19
第一部分小鼠胚胎成纤维细胞的制备  19-21
  材料与方法  19-20
  结果  20-21
第二部分小鼠胚胎干细胞的扩增  21-25
  材料与方法  21-22
  结果  22-23
  讨论  23-25
第三部分碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源暴式集落形成细胞形成的作用研究  25-32
  材料与方法  25-26
  结果  26-29
  讨论  29-32
第四部分胚胎干细胞来源集落形成细胞表面标志的表达研究  32-39
  材料与方法  32
  结果  32-37
  讨论  37-39
第五部分碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源暴式集落形成细胞形成的作用机制研究  39-46
  材料与方法  39-40
  结果  40-44
  讨论  44-46
结论  46-47
参考文献  47-50
硕士在读阶段发表的论文  50-51
综述  51-60
  参考文献  57-60
致谢  60

碱性成纤维细胞生长因子对胚胎干细胞来源暴式集落形成细胞形成的作用及其机制研究

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