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冠心病是危及人类健康的一种常见疾病。近年来,随着人民生活水平的提高和饮食结构的改变,我国冠心病发病率呈上升趋势。冠心病已成为当前危害国人身体健康的最主要疾病之一。由于成熟的心肌细胞属于终末分化细胞,再生能力很弱,一旦心肌遭受不可逆的损伤将导致心肌细胞减少,损伤区难以依靠残余的心肌细胞的增生进行修复,多以纤维瘢痕组织增生来替代坏死的心肌,从而导致心室结构的改变,心肌顺应性下降,心脏壁扩张变薄,导致心功能减退,严重影响患者的生存质量及生活。因此,增加具有完善收缩功能的心肌细胞数目可能成为治疗冠心病的有效途径。传统的治疗方法,无论是药物治疗,手术治疗或者是介入治疗均不能增加心肌细胞,修复梗死心肌。骨髓间充质干细胞是存在于骨髓中的一类非造血干细胞,是中胚层发育的早期细胞,具有多向分化潜能。同时,由于骨髓间充质干细胞具有多向分化和增殖潜能,易于使外源的基因的得到长期和稳定的表达,并且易与周围组织整合而发挥功能,使其成为基因治疗中非常有价值的运载细胞。Shh基因能调节基质细胞分泌众多的血管新生因子,促进毛细血管新生和动脉生成,减少心肌细胞凋亡,促进内皮祖细胞迁移,从而更好的增加心梗区血供,恢复心肌细胞数目,改善心功能。由此,我们设想将细胞移植和血管新生疗法两种方法结合,针对心梗后心肌细胞丧失和相对性缺血缺氧的特点,采用细胞移植技术,联合基因治疗,以求更好的实现心梗后心肌再生和血管新生。本实验分为两个部分。第一部分：Shh基因转染BMMSC。以密度梯度离心一贴壁培养法获取Wistar大鼠BMMSC,采用电转染法将Shh基因导入BMMSC;第二部分：Shh基因转染BMMSC移植对大鼠心功能的影响。将携带Shh基因的BMMSC直接心肌注射到心梗区及其周缘,定期(1周、2周、4周、8周)通过检测心功能、移植细胞的存活和分化等指标,来检验是否优于独立的细胞治疗或基因治疗。第一部分：Shh基因转染骨髓间充质干细胞目的：探讨对大鼠BMMSC进行重组Shh基因修饰的可行性。方法：1.采用密度梯度离心—贴壁培养法获Wistar大鼠BMMSC。测定其生长曲线,表面标志CD34、CD44、CD45和SH3。2.采用电转染法将PCDNA3.1 (-)-SHH转染BMMSC,在倒置显微镜下观察转染后细胞形态和生长情况的变化,通过Western法鉴定Shh在细胞中的表达情况。结果：1.采用密度梯度离心—贴壁培养法易获取大鼠BMMSC,检测结果为CD44、SH3阳性,CD45、CD34阴性。2.Western检测证实采用电转染法能成功地将Shh基因转染至大鼠BMMSC中,并获得有效的表达。结论：真核表达载体PCDNA3.1 (-)-SHH可以成功地在BMMSC中表达,为进一步探讨Shh基因转染BMMSC移植对大鼠心功能及心室重构的影响提供了实验依据。第二部分：血管内皮细胞生长因子基因转染骨髓间充质干细胞移植对大鼠心功能的影响目的：探讨Shh基因转染BMMSC后心肌移植对缺血性心脏病心功能的影响,并比较联合治疗与基因治疗、细胞治疗单独使用的疗效差别。方法：采用雄性wistar大鼠,建立心梗模型四周后,随机均衡分入Shh转染MSC组(A组),MSC组(B组),Shh组(C组),Shh基因+MSC组(D组),注射DMEM培养基组(E组),共5组。再按注射后时间将各组分为1周,2周,4周,8周四个亚组,各亚组保证至少10只动物。到各相应时间后以Buxco系统检测心功能。结果：在第一周时,SLVP在各组间没有明显差异,LVEDP则有A、B、D组低于E组,另外还有A组低于C组,其余各组相比则没有统计学意义,+dp/dtmax测量值中A、C、D组高于E组,-dp/dtmax中有A、C低于E组；第二周时,SLVP中以A、C、D组高于E组, LVEDP在各组间没有差别,+dp/dtmax测量值中有A组高于D组,-dp/dtmax中有A组低于E组；第四周时,A、B、C、D四组在SLVP、+dp/dtmax测量值中均高于E组,而在-dp/dtmax中均低于E组,LVEDP测值中有C、D两组低于E组；到第八周时,A、B、C、D四组在SLVP、+dp/dtmax测量值中均高于E组,而在LVEDP、-dp/dtmax中则均低于E组,此外,在C组与D组的比较中,C组的SLVP、+dp/dtmax测量值均低于D组,而LVEDP、-dp/dtmax测量值均高于D组。在观察各处理组随时间变化心功能的变化情况时,我们发现A、B、C、D四组的心功能在1、2、4、8周均没有明显变化,而在E组中其SLVP、+dp/dtmax呈下降趋势,LVEDP无明显改变,-dp/dtmax则呈上升趋势。结论：shh转染BMMSC移植至心梗区,能有效抑制大鼠慢性心梗模型心功能的持续恶化。shh转染BMMSC与BMMSC、shh、shh+BMMSC相比对提高心梗后心功能无明显差别,但其测量值有好转趋势。
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