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噬菌体库筛选小鼠胚胎干细胞特异结合多肽

作　者: 赵赛娟
导　师: 马岚
学　校: 清华大学
专　业: 生物学
关键词: 小鼠胚胎干细胞 分化的小鼠胚胎干细胞 噬菌体展示 多肽
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


胚胎干细胞是一种能在体外无限增殖并保持自我更新能力的细胞,它能够分化成各种不同类型的细胞。目前对胚胎干细胞的自我更新机制及分化全能性的机理还在进一步的研究中。其中对胚胎干细胞表面特异性蛋白的研究具有非常重要的意义。这种特异性蛋白的存在也许是维持其细胞特异性的依据。本实验利用噬菌体展示技术,得到了九条能与小鼠胚胎干细胞特异性结合的十二肽。这种特异性的多肽可以广泛的应用于胚胎干细胞标记、胚胎干细胞的鉴定、靶向给药以及细胞信号通路等研究。为了除去非特异性的多肽,本实验采用了减数杂交筛选法,即用自由分化的小鼠胚胎干细胞作为负筛材料,除去那些非特异性的噬菌体多肽,然后再用未分化的小鼠胚胎干细胞作为正筛材料,得到能与其特异性结合的多肽。经过四轮的重复筛选之后,随机挑取了20个噬菌体单克隆,并对其进行测序检测,共得到了9条序列。其中除了Seq8没有得到重复序列外,其余的8条序列都得到了重复,这说明噬菌体得到了富集,这种筛选方法是非常有效的。ELISA实验证明这9条序列与未分化的小鼠胚胎干细胞都有着很强的结合力,其中Seq2的结合力最强,而它们与自由分化的小鼠胚胎干细胞及其滋养层细胞ICR的结合力均很弱。免疫荧光实验更直接的反应了Seq2单克隆噬菌体能够特异性的与未分化的小鼠胚胎干细胞细胞表面蛋白结合,而不能与分化细胞及滋养层细胞结合。Western实验证明了Seq2单克隆噬菌体能与未分化的小鼠胚胎干细胞细胞膜上的两种大小约为20KD的膜蛋白结合。这说明,筛选得到的多肽确实具有对小鼠胚胎干细胞的特异性结合能力。这些都说明了,利用噬菌体展示技术对胚胎干细胞的筛选是可行且有效的。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-7
第一章 引言  7-21
  1.1 小鼠胚胎干细胞的研究进展  7-16
    1.1.1 小鼠胚胎干细胞的特征  8
    1.1.2 小鼠胚胎干细胞的培养方法  8-9
    1.1.3 小鼠胚胎干细胞自我更新的机制  9-16
  1.2 小鼠胚胎干细胞体外分化研究进展  16-18
    1.2.1 影响ES 细胞分化的一些因素  17
    1.2.2 ES 细胞的分化  17-18
  1.3 噬菌体展示技术进展  18-20
    1.3.1 基因领域的应用  19
    1.3.2 表位研究领域的应用  19
    1.3.3 细胞信号研究领域的应用  19
    1.3.4 核酸领域的应用  19
    1.3.5 药物领域的应用  19-20
  1.4 研究的目的和研究方法  20
  1.5 研究意义  20-21
第二章 实验材料与方法  21-36
  2.1 实验材料  21-28
    2.1.1 药品和生化材料  21-23
    2.1.2 试剂盒  23
    2.1.3 仪器设备  23-24
    2.1.4 常用溶液及其配制  24-28
    2.1.5 细胞株和菌株来源  28
  2.2 实验方法  28-36
    2.2.1 ICR 原代小鼠胚成纤维细胞（MEF）制备  28-29
    2.2.2 小鼠胚胎干细胞的培养  29-30
    2.2.3 小鼠胚胎干细胞未分化特征的检测  30-31
    2.2.4 小鼠胚胎干细胞自由分化及检测  31-32
    2.2.5 针对未分化小鼠胚胎干细胞的噬菌体库的筛选  32-34
    2.2.6 得到的噬菌体克隆的检测和鉴定  34-36
第三章 小鼠胚胎干细胞未分化特征及分化全能性的检测  36-41
  3.1 未分化小鼠胚胎干细胞形态学的鉴定  36
  3.2 未分化小鼠胚胎干细胞碱性磷酸酶的检测  36
  3.3 未分化细胞表达的特异性基因的RT-PCR 检测  36-38
  3.4 小鼠胚胎干细胞全能性检测  38-39
    3.4.1 小鼠胚胎干细胞拟胚体的形成与鉴定  38-39
    3.4.2 小鼠胚胎干细胞的自由分化  39
  3.5 讨论  39-41
第四章 针对未分化小鼠胚胎干细胞的噬菌体库筛选  41-43
  4.1 噬菌体筛选结果  41
  4.2 单克隆的挑选及初步鉴定  41-43
第五章 所筛选克隆对小鼠胚胎干细胞的特异性检测  43-47
  5.1 全细胞ELISA 检测  43-44
  5.2 免疫荧光检测  44
  5.3 Western blot 检测  44
  5.4 数据库检索结果  44-47
第六章 结论和讨论  47-49
参考文献  49-53
致谢  53-54
个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果  54

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中图分类: > 生物科学 > 生物工程学（生物技术） > 细胞工程
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