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应用酵母双杂交系统筛选RTN4-C相互作用的蛋白

作　者: 唐小军
导　师: 张锡然
学　校: 南京师范大学
专　业: 细胞生物学
关键词: RJN4-C RTN3 酵母双杂交 免疫共沉淀 免疫荧光 细胞凋亡
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


RTNs家族是一类发现比较晚并且功能也不清楚但有着特异拓扑结构的蛋白家族，该家族成员在生物体内有着较广泛的表达。RTNs主要存在于高等脊椎动物中，其成员都含有两个较大的跨膜区并且在蛋白的C端有一个内质网滞留信号(KDEL)。这些同源区大约含跨度200个氨基酸，因为该序列在内质网蛋白中很保守，因此这些序列又称为内质网蛋白同源区(RHD)。在人和鼠中发现至少有4个RTN基因的存在(RTN1，RTN2，RTN3，RTN4)。其中RTN4因近些年来发现它能够抑制中枢神经系统受损后神经元轴突的再生，因此又称为Nogo(neurite outgrowth inhibitor protein)。过表达RTNs家族的RTN3能够阻止内质网和高尔基体之间蛋白的转运，并且能够引起内质网的过载反应，从而导致内质网钙离子的耗竭，引起细胞发生凋亡。本文研究的RTN4-C(Nogo-C)是RTN4基因编码的一个最小的蛋白。我们先前的工作表明过表达RTN4-C能够抑制肝癌细胞株SMMC7721的生长并促进该细胞发生调亡。为了进一步研究该蛋白的功能，本文运用酵母双杂交技术等研究RTN4-C相互作用的蛋白，初步探讨RTN4-C促进细胞凋亡的机制。1．运用酵母双杂交筛选到RTN4-C相互作用的蛋白RTN3本研究以胎鼠的RTN4-C蛋白的全长为诱饵蛋白筛选小鼠7天的胚胎文库，经过回复验证，测序分析共得到3个阳性克隆，分别是RIREN2310016E02，RTN3，Gpihbp1。蛋白相互作用的定量分析表明RIREN2310016E02与RTN4-C作用最强，RTN3次之，Gpihbp1最弱。但是由于RIREN2310016E02的功能还没有报道，Gpihbp1的功能也不明确，且与RTN4-C相互作用较弱，所以本文选择RTN3进一步研究。2．RTN4-C和RTN3相互作用的进一步确定本研究用免疫共沉淀技术验证RTN4-C和RTN3之间的相互作用。将RTN4-C和RTN3分别与Myc和HA蛋白标签融合，在HEK93细胞中过表达这两种融合蛋白。首先以Myc抗体进行免疫共沉淀，在沉淀复合物中用HA抗体进行免疫印迹，检测是否有RTN3融合蛋白，其次以HA抗体进行免疫沉淀，在沉淀复合物中用Myc抗体进行免疫印迹，检测是否有RTN4-C融合蛋白，结果表明RTN4-C和RTN3能够在细胞内发生相互作用。3．RTN4-C和RTN3在细胞内共分布相互作用的蛋白一般在细胞内有着共同的分布，本文同样也研究了RTN4-C和RTN3在细胞内的分布。首先以免疫荧光技术显示RTN4-C和RTN3过表达在HEK293细胞中共分布，其次将RTN4-C和RTN3分别和绿色和红色荧光蛋白融合，直接在荧光显微镜下观察到两者在Hela细胞中共分布。4．RTN4-C通过其疏水区与RTN3相互作用为了进一步明确RTN4-C是通过其自身的哪个结构域与RTN3相互作用，本文构建RTN4-C不同的缺失突变体，分别与RTN3进行免疫共沉淀，结果表明RTN4-C通过其疏水区与RTN3相互作用的。进一步分析了RTN4-C缺失突变体在细胞内的分布，结果表明该蛋白的疏水区在其细胞的亚定位中起重要作用。5．RTN4-C和RTN3的相互作用抑制它们促进细胞凋亡的能力在HEK293细胞中过表达RTN4-C和／或RTN3，运用流式细胞检测技术分析表明，RTN4-C和RTN3在细胞内共表达时细胞发生凋亡的比例较RTN4-C和ETN3单独在细胞内过表达时低。总的来说，本文通过酵母双杂交技术筛选到RTN4-C相互作用的蛋白RTN3，并且验证了它们能够在哺乳动物细胞内也能发生相互作用，该蛋白的疏水跨膜区介导了两者的相互作用，并且通过这种相互作用抑制了RTN4-C促进细胞凋亡的能力。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-9
第一部分 综述  9-18
  第一章 RTNs家族与细胞凋亡的研究进展  9-14
  第二章 RTNs家族相互作用蛋白的研究进展  14-18
第二部分 实验研究  18-58
  第一章 运用酵母双杂交筛选RTN4-C相互作用的蛋白  18-44
    1.材料和试剂  18-23
    2.实验方法  23-33
    3.实验结果  33-42
      3.1 诱饵蛋白载体RTN4-C-pGBKT7在酵母菌AH109中能够正确表达  33-35
      3.2 诱饵蛋白在酵母菌中不存在自激活和毒性现象  35-36
      3.3 诱饵蛋白大量筛选胎鼠文库的结果  36-38
      3.4 阳性克隆的回复验证  38-39
      3.5 阳性克隆的测序结果及生物信息学分析  39-41
      3.6 相互作用的定量分析  41-42
    4.讨论  42-44
  第二章 RTN4-C与RTN3相互作用的验证及功能的初步分析  44-58
    1.材料和试剂  44
    2.实验方法  44-48
      2.1 运用免疫共沉淀验证RTN4-C和RTN3在HEK293细胞中相互作用  44-46
      2.2 运用免疫荧光分析myc-RTN4-C和HA-RTN3在HEK293细胞中的分布  46
      2.3 运用荧光载体分析RTN4-C和RTN3在活细胞内的分布  46-47
      2.4 RTN4-C缺失突变体的构建  47-48
    3.实验结果  48-56
      3.1 免疫共沉淀表明过表达RTN4-C和RTN3能够在HEK293细胞中相互作用  49-50
      3.2 免疫荧光显示过表达RTN4-C和RTN3在HEK293细胞中共分布  50
      3.3 构建荧光载体融合蛋白显示过表达RTN4-C和RTN3在Hela细胞中共分布  50-51
      3.4 RTN4-C通过其疏水区与RTN3相互作用  51-52
      3.5 RTN4-C不同缺失突变体在细胞内的分布  52-56
      3.6 流式细胞技术分析过表达RTN3能够抑制RTN4-C促进HEK293细胞凋亡的能力  56
    4 讨论  56-58
参考文献  58-64
附录  64-65
致谢  65

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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