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sfrp3表达下调对小鼠牙齿发育的影响

作　者: 林燕燕
导　师: 张彦定
学　校: 福建师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: Wnt sfrp3 RNAi Realtime RT-PCR 转基因技术 慢病毒载体系统 牙齿发育
分类号: Q344
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


器官发育的形态发生过程中，Wnt家族信号是调节上皮和间充质之间相互作用的重要生长因子之一，在果（?）（Drosophila）和秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）的遗传学研究，非洲蟾蜍（Xenopus）的异位基因表达研究和小鼠的基因敲除实验中都证明了Wnt家族与胚胎的分节，中枢神经系统的图示形成（CNS patterning）和细胞不对称分化的调控有关。Wnt信号系统也是调节牙齿发育的四大类生长因子之一，sFRP（secreted Fizzled-related protein）是Wnt信号的调控因子，本论文通过抑制sfrp3的表达，研究Wnt信号在牙齿发育过程中所起的作用。利用RNAi技术和慢病毒转基因技术，设计针对sfrp3的siRNA，构建表达shRNA的pNL-EGFP-U6-shsfrp3-Ⅰ和pNL-EGFP-U6-shsfrp3-Ⅱ质粒，使它们分别和pVSVG，pHelper组成慢病毒三质粒转染系统，再共转染293T细胞，生产EGFP-shsfrp3-Ⅰ病毒和EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒。用EGFP-shsfrp3-Ⅰ病毒和EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒分别感染牙间充质细胞，通过Realtime RT-PCR方法检测各个组织的sfrp3的相对表达量，筛选出抑制效率为63％的EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒应用于研究牙齿发育。实验结果是：感染EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒的重组牙胚（E13.5牙间充质+E10.5牙上皮）的成牙率降低。感染EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒的E11.5整牙的早期发育过程会被促进。这些结果都证明了Wnt家族信号系统在牙齿早期发育中具有重要的作用。

全文目录


摘要  2-3
ABSTRACT  3-4
中文文摘  4-10
第1章 前言  10-28
  1.1 研究的目的  10-11
  1.2 牙齿发育概述  11-13
    1.2.1 哺乳动物早期牙齿的发育模式(图1-1)  11
    1.2.2 牙齿发育的分子机制简述  11-13
      1.2.2.1 介导牙齿发生的生长因子  12
      1.2.2.2 转录因子在牙齿发生中的作用  12-13
  1.3 WNTS  13-19
    1.3.1 Wnts的属性  14
    1.3.2 Wnt信号的四条传导通路  14-15
    1.3.3 Wnt信号通路的分泌型拮抗物  15-17
      1.3.3.1 sFRP(secreted Fizzled-related proteins)家族蛋白  15-16
      1.3.3.2 发育中sFRP的表达模式  16
      1.3.3.3 sFRPs可以赋予Wnt活性  16-17
      1.3.3.4 sFRPs和细胞生长的调节  17
    1.3.4 发育中的牙齿表达一系列的Wnt基因  17-19
      1.3.4.1 牙齿发育的起始阶段(E11.5)  17-18
      1.3.4.2 牙蕾时期(E13.5)  18
      1.3.4.3 帽状期(E14.5)  18
      1.3.4.4 钟状早期(E15.5)  18-19
  1.4 基因转移载体  19-23
    1.4.1 HIV慢病毒载体  20-23
      1.4.1.1 慢病毒HIV  20-22
      1.4.1.2 HIV慢病毒载体构建  22-23
  1.5 RNAi  23-26
    1.5.1 RNAi发现背景  23-24
    1.5.2 RNAi的分子机制  24-25
    1.5.3 siRNA的表达  25-26
  1.6 实验设计和意义  26-28
第2章 实验内容  28-66
  2.1 材料  28-31
    2.1.1 菌株和载体  28
    2.1.2 细胞  28
    2.1.3 实验动物  28
    2.1.4 工具酶  28
    2.1.5 主要仪器  28
    2.1.6 耗材  28-29
    2.1.7 试剂  29-30
    2.1.8 引物和探针(Takara)  30-31
  2.2 实验方法  31-44
    2.2.1 sfrp3-siRNA片段的设计  31-32
      2.2.1.1 登录GeneBank查询小鼠sfrp3基因的mRNA全序列  31
      2.2.1.2 siRNA的设计原则  31
      2.2.1.3 合成片段的设计  31-32
      2.2.1.4 合成单链寡聚核苷酸片段  32
      2.2.1.5 单链寡聚核苷酸片段的退火反应  32
    2.2.2 质粒的提取  32-34
      2.2.2.1 小剂量抽提---碱裂解法  32-33
      2.2.2.2 大剂量抽提---QIAGEN-tip100  33-34
    2.2.3 内切酶酶切  34
    2.2.4 末端去磷酸化  34
    2.2.5 琼脂糖凝胶电泳  34-35
    2.2.6 连接  35
    2.2.7 细菌的转化  35
    2.2.8 293T细胞扩培与冻存  35-36
    2.2.9 jetPEI~(TM)试剂盒转染293T细胞,生产EGFP病毒  36-37
    2.2.10 磷酸钙法转染293T细胞,生产EGFP病毒  37
    2.2.11 EGFP病毒感染293T细胞  37-38
    2.2.12 EGFP病毒感染牙间充质细胞  38
    2.2.13 抽提总RNA(动物)  38-39
    2.2.14 RT-PCR(两步法)  39-40
      2.2.14.1 逆转录  39
      2.2.14.2 cDNA的PCR反应  39-40
      2.2.14.3 测序  40
    2.2.15 Realtime RT-PCR  40-42
      2.2.15.1 设计探针  40
      2.2.15.2 Realtime RT-PCR(两步法)  40-41
      2.2.15.3 制作sfrp3标准曲线  41
      2.2.15.4 检测RNAi抑制sfrp3表达的效率  41-42
    2.2.16 组织重组：病毒感染后的E13.5牙间充质与E10.5牙上皮重组  42-43
    2.2.17 整牙移植  43-44
    2.2.18 HE染色  44
    2.2.19 Azon染色  44
  2.3 结果与分析  44-62
    2.3.1 载体的鉴定  44-47
      2.3.1.1 HindⅢ酶切鉴定pSilencer 1.0-U_6-shsfrp3-Ⅰ质粒和pSilencer 1.0-U_6-shsfrp3-Ⅱ质粒  44-45
      2.3.1.2 测序鉴定pSilencer 1.0-U_6-shsfrp3-Ⅰ质粒和pSilencer 1.0-U_6-shsfrp3-Ⅱ质粒  45
      2.3.1.3 XbaI酶切鉴定pNL-EGFP-U_6-shsfrp3-Ⅰ质粒和pNL-EGFP-U_6-shsfrp3-Ⅱ质粒  45-47
    2.3.2 病毒的生产  47-52
      2.3.2.1 pNL-EGFP、pVSVG和pHelper三质粒共转染293T细胞,生产EGFP病毒  47-48
      2.3.2.2 jetPEI~(TM)试剂盒法和磷酸钙法转染293T细胞的比较  48
      2.3.2.3 EGFP病毒液感染293T细胞及牙间充质细胞  48-52
    2.3.3 检测RNAi抑制sfrp3表达的效率  52-55
      2.3.3.1 从总RNA中扩增sfrp3和β-actin基因的部分片段  52
      2.3.3.2 sfrp3标准曲线  52-53
      2.3.3.3 RNAi抑制sfrp_3表达的效率  53-55
    2.3.4 通过抑制牙间充质中sfrp3的表达研究牙齿的发育  55-62
      2.3.4.1 组织重组  55
      2.3.4.2 病毒感染后的E13.5牙间充质与E10.5牙上皮重组的成牙分析  55-56
      2.3.4.3 被EGFP-shsfrp3-Ⅱ病毒感染的E11.5的完整磨牙牙胚和被EGFP病毒感染的E11.5的完整磨牙牙胚发育的形态比较  56-62
  2.4 讨论  62-66
    2.4.1 载体构建  62
    2.4.2 病毒的生产  62-63
    2.4.3 检测RNAi抑制sfrp3表达的效率  63
    2.4.4 通过抑制牙间充质中sfrp3的表达研究牙齿的发育  63-66
结论  66-68
参考文献  68-76
附录一  76-77
附录二  77-78
附录三  78-79
附录四  79-81
攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  81-82
致谢  82-83
个人简历  83-85
福建师范大学学位论文使用授权声明  85

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中图分类: > 生物科学 > 遗传学 > 遗传学分支学科 > 发生遗传学（发育遗传学）、生理遗传学
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