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植物天冬酰胺合成酶基因的抗病性调控功能分析

作　者: 程维舜
导　师: 蔡新忠
学　校: 浙江大学
专　业: 植物病理学
关键词: 天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase，AS) 抗病性 氮代谢 分子机理 病毒诱导的基因沉默(VIGS) 克隆 过量表达 RNAi 番茄 水稻 转基因
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


植物抗病性是一个极其复杂的过程。植物抗性调控基因的克隆和功能分析有利于深入了解植物抗病性的分子机理。天冬酰胺合成酶(asparagine synthetase, AS) (EC 6.3.5.4)通常由一个小的基因家族所编码。该酶为广泛存在于原核和真核生物体内的一类氨基转移酶,以氨或谷氨酰胺以及天冬氨酸为底物催化天冬酰胺的生物合成。它能增强氮从源组织到库组织的重新定位,通过调节氮代谢参与多种生物学功能的调控。然而AS对植物抗病性的调控功能尚不明确。本研究拟分别克隆番茄和水稻AS基因,并采用病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing, VIGS)技术和转基因超量表达和RNAi技术,研究AS基因对植物抗病性的调控功能。获得如下结果：1番茄和水稻天冬酰胺合成酶基因的克隆：根据已知的核苷酸序列,设计番茄和水稻共四对引物,分别以番茄和水稻的cDNA为模板,采用RT-PCR法克隆获得获得长度为1680bp的SlAS1、长度分别为1776bp、1815bp、1512bp的OsAS1、OsAS3和OsAS4全长cDNA序列。2天冬酰胺合成酶基因的抗病功能分析：采用VIGS技术和瞬时超表达分析了AS基因对番茄和本氏烟抗病的调控功能。发现SlAS1基因在番茄沉默植株产生的Cf4/Avr(?)介导产生的过敏性反应(hypersensitive response, HR)症状比对照显著减轻甚至完全丧失。表明SlAS1基因可能对Cf4/Avr(?)介导的HR起重要调控作用。另外,NbAS(即b48)在本氏烟沉默植株产生的稻白叶枯菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)介导产生的过敏性反应症状比对照减轻,而瞬时超表达植株产生的Xoo介导产生的过敏性反应症状比对照则增强。说明AS是植物对Xoo的非寄主抗性的重要调控因子。3番茄和水稻的过量表达和RNAi结构的构建：根据番茄和水稻分别是双子叶和单子叶植物的特性,对番茄AS基因的表达选用35S启动子控制；对水稻AS基因的表达则选用玉米Ubi启动子控制。因此,选用具有卡那霉素抗性植物双元表达载体pCHF3和潮霉素抗性植物双元表达载体pC1301-35S、pCZD、pANDA,构建了适用于番茄的SlAS基因过量表达和RNAi结构pCHF3-SlAS1和pC1301-35S-SlAS1,以及适用于水稻的OsAS基因过量表达和RNAi的结构pCZD-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS(水稻AS基因家族沉默结构)。用电击法将含有AS基因的超表达和RNAi结构分别转入根癌农杆菌EHA105菌株中,阳性转化子用于番茄和水稻的转化。4转基因水稻植株的获得：将含OsAS基因过量表达和RNAi结构的农杆菌与水稻愈伤组织共培养。经潮霉素抗性筛选共获得89个独立的转基因单株,分别获得转过量表达结构pCZD-OsAS1、3、4的再生单株28个、11个和14个；获得转RNAi沉默结构pANDA-OsAS1、3、4和pANDA-OsAS的再生单株7个、12个、14个和2个。T1代苗经潮霉素初步检测大部分为阳性系。5 OsAS基因对水稻农艺性状的影响：大部分转基因植株生长正常,并且超表达植株在长势、植株高度、都优于RNAi植株,家族RNAi植株在这些性状方面又更弱于单基因RNAi植株。

全文目录


致谢  6-10
摘要  10-12
ABSTRACT  12-15
第一章 文献综述:基因表达抑制研究技术与植物天冬酰胺合成酶功能研究进展  15-25
  1.1 引言  15-16
  1.2 基因表达抑制研究技术及其在抗病性中的应用  16-18
    1.2.1 病毒诱导的基因沉默技术及其在鉴定植物基因功能中的应用  16-17
      1.2.1.1 VIGS的作用机制  16
      1.2.1.2 VIGS在鉴定植物基因功能中的应用  16-17
    1.2.2 RNAi技术及其在鉴定植物基因功能中的应用  17-18
      1.2.2.1 RNAi的作用机制及其发展状况  17
      1.2.2.2 RNAi在鉴定植物功能基因中的应用  17-18
    1.2.3 VIGS技术和RNAi技术在鉴定植物基因功能上的区别  18
  1.3 植物天冬酰胺合成酶(AS)基因功能的研究  18-24
    1.3.1 植物AS基因的分类  19
    1.3.2 植物AS的催化机理及其分子结构  19-22
    1.3.3 植物AS基因的组织特异性表达和可诱导表达  22-23
      1.3.3.1 植物AS基因的时间和空间特异性表达  22
      1.3.3.2 植物AS基因的可诱导表达  22-23
    1.3.4 植物AS基因的功能  23-24
      1.3.4.1 植物AS基因的生理功能  23
      1.3.4.2 植物AS基因的抗病功能  23-24
  1.4 本研究的主要目的和研究内容  24-25
第二章 番茄天冬酰胺合成酶基因(AS)的克隆及其功能研究  25-38
  2.1 前言  25
  2.2 材料与方法  25-29
    2.2.1 材料  25-27
      2.2.1.1 植物材料、菌种和质粒  25-26
      2.2.1.2 酶、化学试剂  26
      2.2.1.3 抗生素  26
      2.2.1.4 常用试剂的配制  26-27
    2.2.2 方法  27-29
      2.2.2.1 S1AS基因的PCR克隆  27
      2.2.2.2 DNA序列测定及分析  27
      2.2.2.3 S1AS1和NbAS(即b48)基因功能的VIGS分析  27-28
      2.2.2.4 S1AS1转基因结构的构建及瞬时超表达功能研究  28-29
  2.3 结果与分析  29-31
    2.3.1 S1AS1基因的克隆及序列测定  29
    2.3.2 S1AS1和对照用eGFP的沉默结构构建和VIGS处理  29-30
    2.3.3 S1AS1对Cf介导的过敏性反应的调控作用  30
    2.3.4 AS基因对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae,Xoo)介导的过敏性反应的调控作用  30
    2.3.5 S1AS1超表达载体和RNAi表达载体的构建  30-31
  2.4 讨论  31-38
    2.4.1 AS基因在抗病调控中的作用以及S1AS1基因功能初探  31-32
    2.4.2 S1AS1转基因结构构建  32-38
第三章 水稻天冬酰胺合成酶基因(AS)的克隆及其水稻双元表达载体的构建  38-54
  3.1 前言  38
  3.2 材料与方法  38-43
    3.2.1 材料  38-39
      3.2.1.1 菌种、质粒  38
      3.2.1.2 酶、化学试剂  38-39
      3.2.1.3 抗生素  39
      3.2.1.4 常用试剂的配制  39
    3.2.2 方法  39-43
      3.2.2.1 OsAS基因的PCR克隆  39-40
      3.2.2.2 OsAS基因的PCR产物割胶回收与纯化  40
      3.2.2.3 OsAS基因纯化后的PCR扩增产物3,端加"A"  40
      3.2.2.4 3’端加"A"后的PCR产物的纯化  40
      3.2.2.5 3’端加"A"后的PCR产物与T-vector的连接  40
      3.2.2.6 大肠杆菌DH10b电击感受态的制备和转化  40-41
      3.2.2.7 重组克隆的筛选与鉴定  41-42
      3.2.2.8 DNA序列测定及分析  42
      3.2.2.9 OsAS基因双元表达载体结构的设计构建和鉴定  42-43
      3.2.2.10 植物双元表达载体导入根癌农杆菌EHAl05  43
  3.3 结果与分析  43-44
    3.3.1 OsAS基因超表达载体的构建  43-44
      3.3.1.1 OsAS基因的克隆及序列测定  43
      3.3.1.2 OsAS融合基因超表达结构的构建  43-44
    3.3.2 OsAS基因的RNAi表达结构的构建  44
      3.3.2.1 OsAS基因的部分序列获得及序列测定  44
      3.3.2.2 OsAS基因RNAi表达载体的构建  44
    3.3.3 根癌农杆菌的转化与鉴定  44
  3.4 讨论  44-54
    3.4.1 启动子的选择  44-45
    3.4.2 关于融合筛选标记基因(HA+Tag)  45
    3.4.3 关于水稻的RNAi载体pANDA  45-54
第四章 天冬酰胺合成酶基因的水稻转化及转基因植株的获得  54-68
  4.1 前言  54
  4.2 材料与方法  54-57
    4.2.1 材料  54-55
      4.2.1.1 转化的受体植物  54
      4.2.1.2 菌株与质粒  54-55
      4.2.1.3 培养基和抗生素  55
    4.2.2 方法  55-57
      4.2.2.1 水稻愈伤组织的诱导  55-56
      4.2.2.2 水稻愈伤组织的感染  56
      4.2.2.3 潮霉素抗性植株的再生  56-57
      4.2.2.4 转基因水稻的初步鉴定  57
  4.3 结果与分析  57-58
    4.3.1 OsAS基因的水稻转化及潮霉素抗性植株(超表达和RNAi)的获得  57-58
    4.3.2 OsAS基因的超表达株系和RNAi株系的生长发育区别  58
    4.3.3 转OsAS基因水稻的潮霉素初步鉴定  58
  4.4 讨论  58-68
    4.4.1 影响转化效率的主要因素  58-59
    4.4.2 转不同OsAS基因的水稻组培苗超表达植株和RNAi植株生长状态  59-68
全文小结及后续研究  68-69
参考文献  69-74
附带研究  74-75
附录A:本论文所用缩写词及中文对照  75-76
附录B:主要化学试剂及缓冲液的配制  76-77
附录C:常用培养基配方  77-81
附录D:常用的抗生素和激素及使用浓度  81

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 禾谷类作物 > 稻
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