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SsBHMT基因植物表达载体的构建及其转化拟南芥研究

作　者: 张晏萌
导　师: 余爱丽
学　校: 河北农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: SsBHMT 原核表达拟南芥转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

随着基因工程的发展,可以将植物中不存在的、具有重要生理功能的某些蛋白的编码基因转入植物,达到调节植物生长发育、改良植物产品品质等目的。甜菜碱高半胱氨酸甲基转移酶(BHMT)是一种甲基代谢酶,在动物和微生物体内存在,能够催化甜菜碱的甲基转移到高半胱氨酸上,形成二甲基甘氨酸和甲硫氨酸。目前尚未见植物中存在该基因的相关报道。针对BHMT能够促进甲硫氨酸形成从而促进蛋白质合成的特性,以及甲硫氨酸又是植物中主要甲基供体腺苷甲硫氨酸(SAM)的底物,甲基参与植物中多种代谢与调节等特点,将BHMT转入植物,探讨其在植物中的作用。本实验从新鲜猪肝脏中提取RNA,RT-PCR得到SsBHMT基因的cDNA片段,测序正确后,构建了pET30a-SsBHMT原核表达载体,并转化到大肠杆菌ER2566和BL21(DE3)中,诱导表达并纯化了目的蛋白。SDS-PAGE电泳检测发现在大肠杆菌BL21(DE3)中目的基因没有表达;在ER2566中,上清中有少量表达,主要以不溶性包涵体形式存在。为了提高目的基因在上清中的表达量,对起始诱导菌液OD值、诱导温度、IPTG浓度等条件进行优化,目的蛋白的表达量增大,但主要还是以包涵体的形式存在。因此用变性剂助溶包涵体,纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测在45KDa与66KDa之间有一条带,与预期蛋白大小一致。同时构建了以CaMV 35S启动子驱动的含有SsBHMT基因的真核表达载体p3301-SsBHMT,将该载体通过农杆菌介导的沾花浸染法导入拟南芥中,多次喷洒0.5%的除草剂筛选得到25个株系。从25个转基因株系T0代中挑选14株提取叶DNA,进行SsBHMT基因和BAR基因PCR检测,均为阳性结果,初步确定SsBHMT已导入拟南芥中。本实验通过目的基因SsBHMT的原核表达和纯化,以及构建植物表达载体并将其转化拟南芥,为探讨动物基因SsBHMT对植物生长发育、抗逆等方面的作用研究奠定基础。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
1 前言  8-17
  1.1 BHMT 简介  8-9
    1.1.1 BHMT 参与的代谢途径  8-9
    1.1.2 SsBHMT 基因的结构分析  9
  1.2 外源基因转化植物  9-13
    1.2.1 外源基因在转基因植物中的遗传特性  9-11
    1.2.2 动物基因转化植物  11-12
    1.2.3 外源基因转化拟南芥  12-13
  1.3 植物基因工程对植物改良上的应用  13-16
  1.4 本研究的意义和目的  16-17
2 材料和方法  17-30
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 动物材料  17
    2.1.2 植物材料  17
    2.1.3 菌株及质粒载体  17
    2.1.4 酶和试剂  17-18
    2.1.5 培养基配置  18-19
    2.1.6 仪器设备  19
  2.2 方法  19-30
    2.2.1 猪肝脏SsBHMT 基因的获得方法  19-23
    2.2.2 SsBHMT 基因原核载体构建、表达和纯化方法  23-26
    2.2.3 SsBHMT 基因真核载体构建  26-27
    2.2.4 拟南芥的遗传转化  27-30
3 结果与分析  30-39
  3.1 猪肝脏SSBHMT 基因CDNA 的获得  30-33
    3.1.1 猪肝脏总RNA 检测  30
    3.1.2 目的基因的扩增  30-31
    3.1.3 SsBHMT 基因A-T 克隆的菌液PCR 和酶切鉴定结果  31-32
    3.1.4 测序结果  32-33
  3.2 SSBHMT 基因原核载体构建、表达和纯化  33-36
    3.2.1 原核表达载体的鉴定  33
    3.2.2 蛋白的诱导表达和可溶性分析及条件优化  33-36
  3.3 SSBHMT 基因真核载体构建及转化拟南芥  36-39
    3.3.1 p3301 空质粒载体的NheⅠ双位点单切条件摸索  36
    3.3.2 SsBHMT 基因真核表达载体的构建及酶切鉴定  36-38
    3.3.3 SsBHMT 遗传转化拟南芥及PCR 鉴定  38-39
4 讨论  39-41
  4.1 关于重组蛋白的纯化  39
  4.2 关于NHEⅠ的双位点酶切  39-40
  4.3 关于拟南芥转化  40-41
5 结论  41-42
参考文献  42-47
在读期间发表论文  47-48
作者简介  48-49
致谢  49

SsBHMT基因植物表达载体的构建及其转化拟南芥研究

内容摘要

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