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含CD和ES融合基因重组腺病毒的构建和体外抑瘤作用的研究

作　者: 李菲
导　师: 李冬田
学　校: 天津医科大学
专　业: 病原生物学
关键词: 胞嘧啶脱氨酶内皮抑素融合基因重组腺病毒基因治疗肿瘤
分类号: R73-36
类　型: 硕士论文
年　份: 2002年
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内容摘要

肿瘤基因治疗是近十余年发展起来的治疗恶性肿瘤的新方法，但多数临床试验显示单基因治疗的效果还不能令人十分满意，所以融合基因治疗日趋受到研究者的重视。本研究是在课题组前期研究的基础上，选用了胞嘧啶脱氨酶(CD)自杀基因和内皮抑素(ES)基因。CD基因在肿瘤细胞内表达的胞嘧啶脱氨酶将5-FC转化为5-FU，直接局部破坏瘤细胞；而ES基因在肿瘤细胞内表达的内皮抑素通过抑制肿瘤新生血管内皮细胞的形成，使之不能形成新生血管，阻断瘤细胞的氧气和营养物质供应，同时也阻断了肿瘤的远端转移，达到间接抑瘤作用。本研究将CD和ES基因融合，并插入腺病毒载体构建成具有直、间接双重抑瘤作用的重组腺病毒。本研究首先用PCR方法从课题组构建的含CD基因的重组腺病毒(rAd-CD)中扩增出带有特异插入酶切点的CD基因，将其插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建成pAdTrackCMV-CD，进行酶切及PCR鉴定。然后用合成的带有甘氨酸linker的ES基因上、下游引物从前期构建的含ES基因的原核细胞分泌型表达质粒(pEZZ-18-ES)中扩增出glyES基因片段，再插入到pAdTrackCMV-CD中构建成含CDglyES融合基因的腺病毒穿梭质粒pAdTrackCMV-CDglyES。采用高效、简便的细菌内同源重组方法将上述腺病毒穿梭质粒与E1缺失腺病毒骨架质粒pAdEasy-1共同转化大肠杆菌BJ5183，构建出重组腺病毒质粒prAd-CDglyES。用卡那霉素筛选重组质粒，用限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序对插入基因CDglyES进行鉴定。天律医科大学硕士学位论文 prAd＊经脂质体介导转染293细胞进行包装和扩增，在荧光显微镜下借助报吉基因GFP表达绿色荧光蛋白监控和筛选重组腺病毒。采用氯化艳密度梯度离心纯化病毒，用TCIDS。法滴定重组病毒的滴度。为了证实融合基因CDglyES具有CD和ES基因的双重活性，将纯化重组腺病毒稀释成 IX 10’0 TCID。0／L，分别感染肝癌细胞株 SMMCJ 和宫颈癌细胞株 Hela 24小时，给予前药 5－FC，继续培养 48 ’J’时后，检测肿瘤细胞生长抑制率；并与对照重组病毒rAd．CD和rAdLacZ的肿瘤细胞生长抑制率进行比较。结果显示，本研究构建的 rad（oglyes／sF 系统对 swtwtcJy＊细胞的生长抑制率达 78．2％，与 rAd－LacZ／5－FC系统（52．2％）比较有显著性差异， p＜0＊ 1：YAd－CDglyES／5FC系统（78．1％）和 rAd－CD／5FC系统门．7％）对 Hela细胞的生长抑制率与 rAd－LacZ／5－FC系统（50．2％）比较均有显著性差异，p＜0刀1；而 rAd－CDglyES／5fC系统和 rAdCD／5IC系统比较无显著性差异，p＞0．5。这一结果证实了CDglyES融合基因中，基因的融合未影响CD基因活性。浓缩的rAd－CDglyES细胞培养上清液对脐静脉血管内皮细胞ECV304 增殖的抑制率为 78．7％，而同样浓缩的 rAd－CD细胞培养上清液抑制率仅为 24．2 ％，二者有显著性差异，P＜0刀1。这一结果同样证实了＊＊1社S融合基因中基因的融合未影响ES基因的活性。本研究应用重组腺病毒载体介导CDglyES融合基因进行了初步的体外抑瘤实验，结果显示构建的重组腺病毒rAd（DglyES在体外具有直接和间接抑瘤作用，初步证实了本研究的构思正确。但还有许多工作，如体外抑瘤的肿瘤细胞种类、抑瘤作用与重组病毒和前药用量的相关性、体内抑瘤作用以及和放化疗的协同作用等尚需作进一步深入研究。这些工作一旦完成，将会开辟崭新的基因治疗恶性肿瘤的途径。

全文目录

英文缩略语  4-6
中文摘要  6-10
前言  10-13
第一部分含CDglyES基因重组腺病毒的构建  13-38
  材料与方法  13-25
    1 主要实验仪器  13
    2 主要材料与试剂及配制  13-15
    3 实验方法  15-25
  结果  25-38
    1 构建的pAdTrackCMV-CD质粒的酶切鉴定结果  25-26
    2 构建pAdTrackCMV-CDglyES质粒的双酶切鉴定  26-27
    3 构建的pAd-CDglyES PCR和酶切电泳的鉴定  27-29
    4 插入prAdCDglyES中的CDglyES目的基因的测序结果  29-36
    5 prAd-CDglyES在293细胞中包装、扩增光镜及荧光显微镜图片  36-37
    6 rAd-CDglyES滴度的计算  37-38
第二部分重组腺病毒rAd-CDglyES的体外实验  38-55
  材料与方法  38-41
    1 主要实验仪器  38
    2 材料与试剂  38
    3 实验方法  38-41
  结果  41-49
    1 rAd-LacZ／5-FC、rAd-CD／5-FC和rAd-CDglyES／5-FC系统对SMMC-7721细胞生长的抑制作用  41-44
    2 rAd-LacZ／5-FC、rAd-CD／5-FC及rAd-CDglyES／5-FC系统对Hela细胞生长的抑制作用  44-48
    3 rAd-CDglyES 293细胞培养上清对ECV-304内皮细胞的影响  48-49
  讨论  49-54
  小结  54-55
参考文献  55-59
致谢  59-60
在学期间发表的论文和综述  60-67

含CD和ES融合基因重组腺病毒的构建和体外抑瘤作用的研究

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