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穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率及其机制研究

作　者: 陈翀
导　师: 季守平; 檀英霞
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 穿膜肽蜂毒素聚乙烯亚胺转染效率疏水核心区
分类号: R737.33
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

背景:聚乙烯亚胺(polyethylenimine,PEI)是目前研究最多的非病毒基因载体。然而,与其它非病毒载体一样,其最大缺点是递送效率较低。蜂毒因子melittin是一种穿膜能力较强的穿膜肽,长26个氨基酸(GIGAVLKVLTTGLPA LISWIKRKRQQ),其N端1~20位为带负电的氨基酸形成疏水性核心区(MT20),N端21~24位为带正电荷的氨基酸形成极性头部,与脂类化合物的结构非常相似。Ogris等将melittin与PEI交联,能够在人宫颈癌HeLa细胞中有效增强PEI的基因转染效率。我们在以往的研究中发现直接将melittin的疏水核心区MT20与PEI混合就能够提高PEI介导的基因转染效率,而且我们又发现与melittin同源的蛙皮分泌蛋白florae具有与melittin相似的增强基因转染的特性。目的:本实验主要研究melittin和florae的疏水核心区的穿膜机理及其在支链聚乙烯亚胺(branched polyethylenimine,BPEI)介导的基因转染中的作用。方法:合成了melittin、florae及其疏水核心区(分别命名为MT20和FL20),利用圆二色光谱仪检测melittin、florae、MT20和FL20在模拟膜环境的甲醇溶液中的二级结构;通过溶血试验分别比较melittin与MT20,florae与FL20的穿膜能力;以钙黄绿素为示踪物质观察加入melittin、MT20、florae和FL20前后,钙黄绿素在HeLa细胞中的分布情况;将四种多肽与支链聚乙烯亚胺(BPEI,25KD)按一定比例混合后,再与pGL3-Control或pEGFP-N1质粒DNA混合,通过DNA凝胶迟滞实验检测四种多肽对BPEI结合质粒DNA能力的影响;使用动态光散射粒径仪检测多肽/BPEI/DNA复合物的颗粒大小和表面电势;将复合物加入293FT、B16F10和CHO-K1细胞中检测其基因转染效率;以MTT法检测基因转染后细胞存活率。结果:二级结构检测显示在模拟膜环境的甲醇溶液中,melittin和MT20都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为53%和29%。Florae和FL20也都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为52%和34%。溶血结果显示当MT20和FL20的浓度为12μM时,其在中性(pH 7.4)缓冲液中的溶血率分别为73%和81%,在酸性(pH 5.4)缓冲液中的溶血率分别为41%和53%,并且随着MT20或FL20浓度的增加其溶血率都逐步提高,当浓度达到24μM时,MT20和FL20在中性(pH 7.4)缓冲液中的溶血率分别为98%和91%,在酸性(pH 5.4)缓冲液中的溶血率分别为34%和60%。当melittin和florae的浓度为12μM时,其在中性(pH 7.4)缓冲液中的溶血率分别为80%和82%,且随着melittin或florae浓度的增加其溶血率逐步提高,当浓度达到24μM时,melittin和florae的溶血率分别为90%和96%,melittin和florae在酸性(pH 5.4)缓冲液中都基本不发生溶血(6%和10%)。钙黄绿素胞内扩散实验显示,对照组中进入HeLa细胞内的钙黄绿素量很少并且基本上都聚集在溶酶体内,加入melittin、florae、MT20或FL20后都能够促进钙黄绿素进入HeLa细胞,在MT20和FL20组中,钙黄绿素均匀分布在整个细胞当中(包括细胞质和细胞核),而在melittin和florae组中,钙黄绿素呈颗粒状分布在细胞质中并且在核仁内蓄积。凝胶阻滞实验表明四种多肽对BPEI复合DNA的能力没有影响。多肽/BPEI/DNA复合物粒径检测显示,质量比为1.5:1:1(N/P=7.5)和3:2:1(N/P=15)时,加入多肽后复合物的粒径维持在180~648 nm之间,当质量比为6:4:1(N/P=30)时复合物粒径有所增高(310~10~96 nm)。复合物表面电势检测显示,随着复合物中多肽和BPEI含量的增加其表面电势略有增高,其中melittin/florae组为7~26 mv, MT20/FL20组为4~22 mv。基因转染实验表明,加入四种不同的多肽后都能够不同程度地提高BPEI在293FT、B16F10和CHO-K1细胞中的基因转染效率并且MT20、FL20的增强作用要分别强于melittin和florae。在293FT细胞中当多肽/BPEI质量比为1.5:1(N/P=7.5)时基因转染效率最高,其中MT20和FL20组荧光素酶表达量分别达到3.34×10~9 RLU/mg和3.17×10~9 RLU/mg,分别是BPEI组的2.5倍和2.4倍,是Lipofectamine 2000组的2.2倍和2.1倍。在B16F10细胞中当多肽/BPEI质量比为1.5:1(N/P=7.5)时基因转染效率最高,其中MT20和FL20组荧光素酶表达量分别达到1.73×10~9 RLU/mg和2.03×10~9 RLU/mg,分别是BPEI组的2.2倍和2.5倍,是Lipofectamine 2000组的2倍和2.3倍。在CHO-K1细胞中当多肽/BPEI质量比为3:2(N/P=15)时基因转染效率最高,其中MT20和FL20组荧光素酶表达量分别达到3.98×10~9 RLU/mg和3.66×10~9 RLU/mg,分别是BPEI组的4.3倍和4倍,是Lipofectamine 2000组的27.6倍和25.4倍。MTT法检测基因转染后的细胞存活率,结果显示在293FT细胞中MT20和FL20组的细胞存活率分别为86%和83%,melittin和florae组分别为71%和85%,BPEI和Lipofectamine 2000组分别为71%和83%。在B16F10细胞中MT20和FL20组的细胞存活率分别为68%和74%,melittin和florae组分别为68%和71%,BPEI和Lipofectamine 2000组分别为62%和57%。在CHO-K1细胞中MT20和FL20组的细胞存活率分别为93%和95%,melittin和florae组分别为87%和90%,BPEI和Lipofectamine 2000组分别为86%和48%。结论:MT20和FL20主要通过穿膜作用促进BPEI/DNA复合物进入细胞、从溶酶体内释放以及进入细胞核而增强BPEI介导的基因转染效率,提示melittin和florae的疏水核心区MT20和FL20是高效低毒的转染增强剂。

全文目录

英文缩略词表  5-7
摘要  7-11
ABSTRACT  11-15
前言  15-19
实验材料  19-23
  一、细胞和质粒  19-20
  二、主要试剂  20
  三、主要试剂配制  20-22
  四、主要仪器设备  22-23
实验方法  23-27
  一、多肽合成  23
  二、多肽二级结构的测定  23-24
  三、溶血实验  24
  四、钙黄绿素扩散实验  24
  五、多肽/BPEI/DNA复合物的颗粒大小及表面电势检测  24
  六、DNA凝胶电泳迟滞实验  24-25
  七、基因转染实验  25
  八、基因转染效率的分析  25-26
  九、细胞毒性分析  26-27
实验结果  27-43
  一、多肽二级结构的测定  27-28
  二、多肽穿膜能力的比较  28-31
  三、穿膜肽促进细胞内含体中钙黄绿素的释放  31-33
  四、多肽/BPEI/DNA复合物的物理性质  33-36
  六、多肽增强BPEI的基因转染效率  36-41
  七、穿膜肽对细胞的毒性分析  41-43
讨论  43-49
总结  49-51
参考文献  51-57
综述  57-64
参考文献  64-70
  个人简历  69-70
致谢  70

穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率及其机制研究

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