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KGF-2和穿膜型KGF-2的构建、纯化及其对人脐带间充质干细胞增殖、分化的影响

作　者: 荣靖
导　师: 王一飞
学　校: 暨南大学
专　业: 遗传学
关键词: 人脐带间充质干细胞 人角质细胞生长因子 穿膜肽 分化 MAPK通路
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：建立从人脐带中有效分离培养间充质干细胞(MSCs, mesenchymal stem cells),并能进行体外扩增传代的方法；同时构建并表达、纯化人角质细胞生长因子2 (keratinocyte growth factor 2, KGF-2)以及穿膜型KGF-2,研究其对人脐带MSCs(hUC-MSCs, human umbilical cord MSCs)增殖的影响；并研究KGF-2对细胞成脂成骨成脂分化的影响,同时对其作用机制进行初步探讨。方法：采用组织块贴壁法,体外分离获得hUC-MSCs;构建pET28a-KGF-2及TAT-pET28a-KGF-2重组质粒,将其转化大肠杆菌Rosetta(DE3),通过表达条件优化获得目的蛋白并进行可溶性纯化；在对所纯化蛋白进行鉴定及活性检测后,MTT法检测其对细胞增殖的作用；利用Western blot及试剂盒检测KGF-2蛋白对细胞碱性磷酸酶ALP及钙沉积量等成骨标记的影响,通过实时定量PCR检测KGF-2蛋白对PPARγ2及GPDH等成脂标记的影响;利用Western blot检测MAPK通路中ERK1/2及p38途径的改变。结果：1、组织块贴壁法可在10-15天内获得可体外扩增传代的,且具有MSCs表面抗原标记的hUC-MSCs,体外诱导可分化为脂肪细胞和成骨细胞。2、成功构建pET28a-KGF-2及TAT-pET28a-KGF-2重组质粒,通过表达条件的优化获得高效、可溶性表达的KGF-2及TAT-KGF-2重组蛋白。3、高浓度的KGF-2及TAT-KGF-2重组蛋白均可对hUC-MSCs产生促增殖作用,且TAT-KGF-2达到最大细胞增殖速率所需蛋白浓度高于KGF-2重组蛋白。4、一定浓度的KGF-2重组蛋白可有效促进细胞成骨分化,但对成脂分化无明显影响。在对其机制的研究中发现,KGF-2可激活ERK1/2通路,在该通路被抑制时,KGF-2的促成骨分化作用也受到抑制。结论：成功分离得到可体外传代的hUC-MSCs;获得高效、可溶性表达、且具有活性的KGF-2及TAT-KGF-2重组蛋白,其能够促进hUC-MSCs的增殖；其中KGF-2重组蛋白对细胞成骨分化也具有促进作用,该作用很可能是通过激活ERK1/2途径实现。

全文目录


摘要  4-5
ABSTRACT  5-6
目录  6-8
前言  8-20
  1. 间充质干细胞及其应用进展  8-13
    1.1 间充质干细胞简介  8
    1.2 MSCs的生长特性  8-9
    1.3 MSCs的表面抗原  9-10
    1.4 MSCs的诱导分化  10-11
    1.5 脐带间充质干细胞  11-13
  2. 角质细胞生长因子2  13-15
    2.1 角质细胞生长因子2简介  13
    2.2 KGF-2的生物学功能与疾病治疗  13-14
    2.3 KGF-2的作用机制  14-15
  3. 穿膜肽简介  15
  4. MAPK通路与MSCs  15-17
    4.1 MAPK通路简介  15-16
    4.2 MAPK通路与MSCs的分化  16-17
  5. 本研究的目的及意义  17-18
  6. 本研究的创新点  18-19
  7. 技术路线  19-20
第一章 重组KGF-2蛋白的克隆、表达及纯化鉴定  20-40
  1. 实验材料和设备  20-25
  2. 实验方法  25-34
  3. 实验结果  34-40
    3.1 表达质粒的构建及测序分析  34-35
    3.2 重组KGF-2蛋白在大肠杆菌中的表达及最佳表达条件的筛选  35-37
    3.3 重组KGF-2蛋白的纯化鉴定  37-38
    3.4 重组KGF-2蛋白的活性检测  38-40
第二章 重组TAT-KGF-2蛋白的克隆、表达及纯化鉴定  40-47
  1. 实验材料和设备  40
  2. 实验方法  40-43
  3. 实验结果  43-47
    3.1 表达质粒的构建及测序分析  43-44
    3.2 重组TAT-KGF-2蛋白在大肠杆菌中的表达  44
    3.3 重组TAT-KGF-2蛋白的纯化鉴定  44-45
    3.4 重组TAT-KGF-2蛋白的活性鉴定  45-47
第三章 KGF-2及TAT-KGF-2对hUC-MSCs增殖、分化的作用及其初步机制研究  47-64
  1. 实验材料及试剂  47-50
  2. 实验方法  50-55
  3. 实验结果  55-64
    3.1 hUC-MSCs的体外分离及培养  55-56
    3.2 hUC-MSCs的鉴定  56-58
    3.3 重组蛋白KGF-2及TAT-KGF-2对hUC-MSCs生长的影响  58-59
    3.4 KGF-2对hUC-MSCs成骨及成脂分化的影响  59-61
    3.5 KGF-2对ERK1/2及p38通路的影响  61-62
    3.6 抑制ERK1/2及p38通路对hUC-MSCs成骨及成脂分化的影响  62-64
第四章 讨论  64-67
结论与展望  67-68
  1.结论  67
  2.展望  67-68
参考文献  68-73
附录  73-78
致谢  78

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中图分类: > 医药、卫生 > 基础医学 > 人体形态学 > 人体组织学
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