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人Oct4蛋白诱导神经干细胞为iPS细胞的初步研究

作　者: 周承亮
导　师: 钱其军
学　校: 浙江理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 多能性干细胞 iPS细胞 蛋白表达 细胞穿膜肽 小分子药物
分类号: Q2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


多能性干细胞是一类具有无限自我更新能力及分化为功能细胞的多潜能特殊细胞。科学家们通过各种方法希望获得多能性干细胞,然而目前方法都存在一定问题。通过4种转录因子诱导将已分化成体细胞重编程为多能性干细胞(iPS细胞),很好的解决了目前存在于多能性干细胞获得中的问题。但是iPS细胞的诱导方法并不完善,需要解决其安全性和诱导效率方面的问题。本课题通过原核表达人类Oct4蛋白与细胞穿膜肽融合蛋白,利用人神经干细胞对单个蛋白诱导iPS细胞进行了探索,主要结果如下:(1)利用pET系统构建了带有人类Oct4转录因子、11-Arginine穿膜肽和6×His纯化标签的原核表达载体。将重组质粒转化入含大肠杆菌稀有密码子的Rostta2(DE3)工程菌以终浓度为1mM的IPTG,28℃12h诱导表达,获得了43kDa左右的hOct4-11R-His融合蛋白,蛋白处于细菌裂解上清中。经Ni+纯化柱纯化,经Western blotting检测表明融合蛋白表达正确。(2)利用EGFP-11R-His和罗丹明标记的hOct4-11R-His蛋白加入BJ和人神经干细胞观察穿膜肽进入细胞情况。证明蛋白加入量为10ug/ml时穿膜效率高且细胞状态好。hOct4-11R-His蛋白对神经干细胞具有高效的穿膜效率和细胞核趋向性。(3)利用hOct4-11R-His诱导人神经干细胞ReNcell NSC,以终浓度为10ug/ml加入细胞,12h后换液培养4天为一轮,4轮后细胞出现克隆样生长。经AP染色后部分细胞呈阳性,定量PCR检测Oct4和Nanog基因明显上调。蛋白直接诱导iPS细胞避免了病毒和其他以DNA为基础重编程方法所产生的潜在隐患,不涉及任何的遗传修饰,是目前最安全的诱导方法,我们的研究证明通过单个蛋白诱导多能性干细胞是可行的,为进一步研究奠定了基础。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-13
第一章 前言  13-19
  1.1 多能性干细胞  13-14
  1.2 诱导多能性干细胞  14-16
  1.3 Oct4 转录因子  16
  1.4 细胞穿膜肽  16-17
  1.5 本课题的创意和研究内容  17-19
    1.5.1 本课题的创意  17-18
    1.5.2 本课题的研究内容  18-19
第二章 表达载体构建  19-28
  2.1 实验器材与方法  19-20
    2.1.1 实验材料  19
    2.1.2 所需主要仪器  19-20
    2.1.3 所需引物  20
  2.2 载体构建  20-23
    2.2.1 人类Oct4 基因PCR 获得  20-21
    2.2.2 酶切  21-22
    2.2.3 连接  22
    2.2.4 pET21-hOct4-11R-His 质粒的鉴定  22-23
  2.3 结果  23-25
    2.3.1 人类Oct4 基因PCR 获得结果  23-24
    2.3.2 pET21-11R-His 载体酶切结果  24
    2.3.3 质粒pET21-hOct4-11R-His 的鉴定  24-25
    2.3.4 pET21-hOct4-11R-His 酶切鉴定结果  25
    2.3.5 重组质粒测序结果  25
  2.4 讨论  25-28
第三章 蛋白表达纯化及鉴定  28-38
  3.1 实验器材  28-31
    3.1.1 实验材料  28
    3.1.2 实验所需仪器  28
    3.1.3 实验所需主要试剂  28-29
    3.1.4 主要试剂配置方法  29-31
  3.2 蛋白表达方法及纯化方法  31-34
    3.2.1 重组质粒的转化入表达菌株  31
    3.2.2 重组质粒在大肠杆菌Rosetta2(DE3)中的表达  31-32
    3.2.3 SDS-PAGE 电泳检测  32-33
    3.2.4 蛋白的透析与浓缩  33
    3.2.5 BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸）法测蛋白浓度  33
    3.2.6 Western Blotting 鉴定方法  33-34
  3.3 结果  34-37
    3.3.1 hOct4-11R-His 蛋白表达纯化结果  34-36
    3.3.2 hOct4-11R-His 蛋白Western Blotting 鉴定结果  36-37
  3.4 讨论  37-38
第四章 穿膜肽功能及诱导神经干细胞实验  38-49
  4.1 实验器材  38-39
    4.1.1 实验材料  38
    4.1.2 实验仪器  38
    4.1.3 实验试剂  38-39
    4.1.4 实时定量PCR 引物  39
  4.2 穿膜肽功能及蛋白诱导神经干细胞实验方法  39-43
    4.2.1 细胞培养  39-40
    4.2.2 ReNcell NSC 的传代  40
    4.2.3 EGFP-11R-His 蛋白及罗丹明标记的hOct4-11R-His 蛋白穿膜实验  40-41
    4.2.4 蛋白诱导ReNcell NSC 实验  41
    4.2.5 定量PCR 检测干细胞标志基因表达  41-43
  4.3 结果  43-48
    4.3.1 EGFP-11R-His 穿膜实验结果  43-44
    4.3.2 罗丹明标记的hOct4-11R-His 蛋白穿膜实验  44
    4.3.3 穿膜肽对ReNcell 神经干细胞穿膜效果  44-45
    4.3.4 hOct4-11R-His 诱导ReNcell 神经干细胞结果  45-46
    4.3.5 碱性磷酸酶染色(AP 染色)结果  46-47
    4.3.6 定量PCR 结果  47-48
  4.4 讨论  48-49
参考文献  49-53
致谢  53-54
附录：hOct4 测序报告  54-55

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中图分类: > 生物科学 > 细胞生物学
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