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TAT-MT融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及体外活性初步测定

作　者: 刘皓熙
导　师: 黄亚东
学　校: 暨南大学
专　业: 生物工程
关键词: 穿膜肽人金属硫蛋白融合蛋白金属螯合
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：构建Tat蛋白转导结构域(Tat-Protein Transduction Domain, Tat-PTD)与人金属硫蛋白(Metallothionein, MT)的融合基因的重组工程菌株,经诱导可溶性表达重组蛋白TAT-MT,分离纯化和鉴定目的蛋白,并检测其对金属离子的螯合能力。方法：设计特异引物,用PCR方法扩增得到编码TAT-PTD和MT融合蛋白的DNA片段,将该片段与表达载体pET3c连接,得到重组质粒pET3c-Tat-MT,并转化到大肠杆菌BL21 (DE3) PlySs中,SDS-PAGE筛选重组表达菌株。通过探讨温度、碳源、氮源等因素对融合蛋白TAT-MT表达的影响,优化工程菌的表达条件。采用Ni-NTA Resin纯化目的蛋白TAT-MT,原子吸收光谱测定工程菌对金属离子的螯合能力。结果：将编码TAT-MT融合蛋白的DNA片段克隆到原核表达载体pET-3c中,并转化大肠杆菌BL21 (DE3) plySs,经筛选获得阳性重组子。1mM IPTG 20℃诱导20h后,获得表观分子量约为15kd的目的蛋白。在重组蛋白小试发酵实验中(5L),重组菌湿菌重可达30g/L,重组蛋白表达量占菌体总蛋白18%。离心收集菌体后,超声破碎,取其上清利用Ni-NAT Resin组氨酸亲和层析柱进行纯化,获得目的蛋白TAT-MT,凝胶扫描结果显示其纯度为85%。原子吸收光谱测定结果显示,重组工程菌对镉和铜离子的螯合能力与对照菌株相比分别提高2.5倍和1.27倍,重金属螯合活性存在显著性差异(p<0.05)。结论：融合蛋白TAT-MT在重组工程菌中获得高效表达,含重组质粒的工程菌具有螯合金属离子的能力。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-8
第一章文献综述  8-20
  1 金属硫蛋白研究进展  8-14
    1.1 MT的结构和理化性质  9-10
    1.2 MT的生物学功能  10-14
  2 穿膜肽的研究进展  14-18
    2.1 穿膜肽简介  14-15
    2.2 穿膜肽的结构  15-16
    2.3 穿膜肽的穿膜机制  16-17
    2.4 穿膜肽的应用  17-18
  3 论文背景  18-19
  4 技术路线图  19-20
第二章 TAT-MT基因的克隆、表达和纯化  20-45
  1 实验设备  20-27
    1.1 主要设备和器材  20-21
    1.2 DNA及蛋白材料  21
    1.3 实验菌株及细胞株  21-22
    1.4 培养基与抗生素  22-24
    1.5 实验试剂  24-27
  2、实验方法与步骤  27-45
    2.1 基因的设计、扩增与克隆  27-30
    2.2. 重组载体pET3c-Tat-MT的构建  30-35
    2.3、Tat-MT在大肠杆菌中的表达  35-37
    2.4、TAT-MT表达条件的筛选  37-39
    2.5 基因工程菌在发酵罐中的高效表达  39-40
    2.6 TA-TMT融合蛋白的分离纯化  40-44
    2.7 重组菌的原子吸收光谱测定  44-45
第三章实验结果  45-54
  1 基因的PCR扩增  45
  2 重组质粒双酶切鉴定  45-46
  3 重组克隆PCR鉴定结果  46-47
  4. 序列分析测定  47
  5. 重组蛋白的表达  47-50
    5.1 温度对表达的影响及可溶性分析  47-48
    5.2 培养基优化  48-50
  6 基因工程菌的小试发酵  50
  7 重组蛋白的纯化  50-51
  8 Western blot鉴定  51-52
  9 原子吸收光谱测定结果  52-54
    9.1 Cd~(2+)的吸收  52-53
    9.2 Cu~(2+)的吸收  53-54
第四章讨论  54-57
  1 MT的表达与条件优化  54-55
  2 重组蛋白的检测与结果分析  55
  3 下一步工作设想  55-57
第五章结论  57-58
参考文献  58-63
附录一英文缩略词表  63-64
附录二测序图谱  64-67
致谢  67

TAT-MT融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达、纯化及体外活性初步测定

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