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融合蛋白PEP-1-vMIP-Ⅱ的表达及其抗HIV-1功能研究

作　者: 罗燕
导　师: 杨磊；谭晓华
学　校: 石河子大学
专　业: 遗传学
关键词: 病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ 细胞穿膜肽pep-1 原核表达 抗HIV-1基因
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


目的：原核表达细胞穿膜肽pep-1和病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ(viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ)的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,并检测该融合蛋白是否具有穿透细胞膜从而发挥激活多种抗HIV-1基因表达上调的功能。为vMIP-Ⅱ发展成为一种新型的、易于给药的防治艾滋病新药提供基础数据。方法：以KSHV基因组为模板,PCR扩增出vMIP-Ⅱ的开放阅读框。将化学合成的细胞穿膜肽pep-1和vMIP-Ⅱ基因克隆入原核表达载体pET15b,构建原核表达载体的pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ质粒和对照载体pET15b-vMIP-Ⅱ。重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3) plysS, IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot鉴定表达产物,Ni-NTA琼脂亲和层析纯化回收目的蛋白。分别取10μg/mL的融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ和不含穿膜肽序列的对照组蛋白vMIP-Ⅱ处理Hela细胞,激光共聚焦显微镜观察该融合蛋白的穿膜功能。以200nmol/l的融合蛋白和对照蛋白同时分别处理HMEC-1细胞和Jurkat细胞,收集细胞,抽提总RNA,荧光定量PCR检测抗HIV基因(MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F)的表达情况。结果：成功构建了原核表达载体pET15b-pep-1-vMIP-Ⅱ和pET15b-vMIP-Ⅱ, DNA序列比对分析表明表达载体具有正确的序列和阅读框。表达并纯化出可溶性pep-1-vMIP-Ⅱ融合蛋白及vMIP-Ⅱ蛋白。激光共聚焦显微镜观察结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能穿透细胞膜进入细胞核内,vMIP-Ⅱ蛋白不能进入细胞核内。荧光定量PCR结果显示：融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调3.36、2.21、1.40、2.09、2.72倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.80、158.63、97.29、2.18、2.43倍。vMIP-Ⅱ蛋白能使Jurkat细胞中抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调9.70、22.03、1.59、1.79、1.85倍；使HMEC-1细胞抗HIV基因MX1、MX2、CCL5、APOBEC3G、APOBEC3F分别上调57.77、159.66、108.77、2.36、2.31倍。两种蛋白在Jurkat和HMEC-1细胞中上调ARGS的表达的功能无显著差异。结论：成功在大肠杆菌中诱导表达出融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ,融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ能够穿透细胞膜进入细胞核内,pep-1-vMIP-Ⅱ与vMIP-Ⅱ蛋白激活多种抗HIV-1基因表达功能无显著差异。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
英文缩略语表  9-10
引言  10-11
第一章 文献综述  11-15
  1.1 抗HIV-1的趋化因子及其类似物  11-13
    1.1.1 阻断CCR5的抑制剂——RANTES及其衍生物  11-12
    1.1.2 阻断CXCR4的抑制剂——SDF-1  12-13
  1.2 APOBEC3G  13
  1.3 Ⅰ型干扰素和2',5'寡腺苷酸合成酶  13-14
  1.4 小结与展望  14-15
第二章 材料  15-20
  2.1 菌株、质粒和细胞株  15
  2.2 主要试剂  15-16
  2.3 主要仪器设备  16-17
  2.4 常用试剂配制  17-19
  2.5 REAL-TIME PCR引物  19
  2.6 引物处理  19-20
第三章 方法  20-33
  3.1 构建原核表达质粒PET15B-PEP-1-VMIP-Ⅱ  20-25
    3.1.1 质粒扩增及抽提  20-21
    3.1.2 质粒pET15b的酶切和大片段DNA回收  21-22
    3.1.3 目的基因的PCR扩增  22-23
    3.1.4 将vMIP-Ⅱ基因克隆至pGEM-T easy载体  23-25
  3.2 融合蛋白PEP-1-VMIP-Ⅱ的表达纯化及鉴定  25-28
    3.2.1 诱导重组蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ诱导及优化  25-26
    3.2.2 融合蛋白的可溶性分析  26
    3.2.3 融合蛋白pep-1-vMIP-Ⅱ的纯化和鉴定  26
    3.2.4 BCA蛋白定量  26-27
    3.2.5 Western-blot鉴定目的蛋白  27-28
  3.3 激光共聚焦显微镜检测融合蛋白的穿膜功能  28-30
    3.3.1 细胞复苏  28
    3.3.2 细胞换液和传代  28
    3.3.3 细胞的冻存  28-29
    3.3.4 细胞计数  29
    3.3.5 检测融合蛋白的穿膜实验  29-30
  3.4 QRT-PCR检测JURKAT细胞/HMEC-1细胞中ARGS MRNA水平的表达  30-32
    3.4.1 处理细胞  30
    3.4.2 细胞总RNA提取与浓度测定  30-31
    3.4.3 逆转录PCR  31
    3.4.4 qRT-PCR测定抗HIV相关基因的表达  31-32
  3.5 技术路线图  32-33
第四章 实验结果  33-44
  4.1 目的基因PCR扩增及TA克隆  33-34
  4.2 原核表达载体的双酶切鉴定  34
  4.3 DNA测序  34-35
  4.4 融合蛋白PEP-1-VMIP-Ⅱ的诱导表达  35-36
  4.5 融合蛋白的可溶性分析及优化  36-38
  4.6 融合蛋白的鉴定  38
  4.7 激光共聚焦检测穿膜情况  38
  4.8 QRT-PCR检测融合蛋白作用于JURKAT细胞ARGS MRNA的表达水平  38-41
  4.9 QRT-PCR检测融合蛋白作用于HMEC-1细胞ARGS MRNA的表达水平  41-44
第五章 实验讨论  44-47
  5.1 细胞穿膜肽  44-45
  5.2 体内主要的抗HIV基因  45
  5.3 KSHV在抗HIV感染方面可能的作用  45-46
  5.4 VMIP-Ⅱ基因在激活抗HIV基因表达方面的作用  46-47
第六章 小结与展望  47-48
参考文献  48-51
致谢  51-52
作者简介  52-53
导师评阅表  53

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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