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不同穿膜肽融合蛋白的抑瘤活性及穿膜活性的研究

作　者: 华迪
导　师: 赵健
学　校: 华东理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides，CPP) TAT EC-SOD 凋亡素 arginine-rich peptides 肝素结合域
分类号: R96
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

细胞穿膜肽(Cell-penetrating peptides, CPPs)是一种最常见的运载体,具有典型的带正电荷的短序列,提供了一条运输物质进入到细胞内的有效通路。借助于凋亡素VP3和增强型荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein, EGFP)作为示踪蛋白,经过表达及分离纯化而得到不同的穿膜肽融合蛋白。对连接有VP3的穿膜肽融合蛋白HBD-VP3和TAT-VP3进行药理比较实验,同时对连接有EGFP的穿膜肽融合蛋白进行穿膜实验比较研究,通过这两项研究来反映新型的穿膜肽HBD的穿膜活性。利用本实验室已成功构建的连接有凋亡素的穿膜肽融合蛋白表达载体：HBD-VP3-pET28a和TAT-VP3-pET28a, HBD-VP3和TAT-VP3这两种融合蛋白成功表达后,并通过包涵体变复性的方法得以成功纯化,然后用体外抑制实验(MTT法)进行对HeLa细胞的生长情况进行检测。研究结果表明,HBD-VP3和TAT-VP3均具有明显的抑制肿瘤细胞增殖的作用,但HBD介导VP3进入细胞的效率比TAT的效率低。本文利用EGFP作为报告基因与细胞穿膜肽HBD和R7的序列进行连接,通过克隆表达的HBD-EGFP和R7-EGFP融合蛋白经Ni-NTA纯化后,对其不同肿瘤细胞中的穿膜活性进行了比较研究,同时鉴定穿膜肽HBD和R7是否具有肿瘤细胞特异性。研究表明,穿膜肽HBD和R7随着穿膜时间的不同,基本能携带EGFP进入到这五种不同的肿瘤细胞内。然而与R7相比,HBD介导EGFP蛋白进入细胞的效率相对较低。HBD介导蛋白实现跨膜的效率有待于进一步的提高,因而可以考虑设计有效的HBD突变体。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章前言  11-23
  1.1 细胞穿膜肽的概述  11-12
  1.2 细胞穿膜肽的跨膜途径  12-14
  1.3 生物活性的物质的穿膜肽运输  14-16
    1.3.1 小分子物质的运输  14-15
    1.3.2 多肽和蛋白质分子的穿膜肽运输  15-16
  1.4 细胞穿膜肽在肿瘤治疗方面的潜力  16-21
    1.4.1 凋亡蛋白的抗肿瘤特性  17-18
    1.4.2 新型的细胞穿膜肽-人源性的肝素结合域(HBD)  18-21
  1.5 课题的研究背景及意义  21-23
第二章材料与方法  23-38
  2.1 蛋白表达纯化实验的常用材料与仪器  23-26
    2.1.1 重组质粒与菌株  23
    2.1.2 主要溶液及各种实验试剂的配制方法  23-25
      2.1.2.1 大肠杆菌表达的培养基、诱导剂和抗性的配制  23
      2.1.2.2 SDS-PAGE蛋白电泳所用试剂的配制  23-25
      2.1.2.3 蛋白浓度测定相关试剂的配制  25
    2.1.3 实验主要仪器  25-26
  2.2 实验方法之蛋白表达纯化  26-32
    2.2.1 大肠杆菌的培养方法和菌种保藏  26
    2.2.2 大肠杆菌的转化  26-27
    2.2.3 聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS-PAGE)实验操作方法  27
    2.2.4 用Bradford法测定蛋白浓度  27-28
      2.2.4.1 蛋白标准曲线的制作方法  27-28
      2.2.4.2 目的蛋白浓度的测定方法  28
    2.2.5 pET28a-TAT-VP3和pET28a-HBD-VP3在E.coli中的诱导表达鉴定  28-30
      2.2.5.1 HBD-VP3融合蛋白的诱导表达  28
      2.2.5.2 TAT-VP3融合蛋白的诱导表达  28-29
      2.2.5.3 HBD-EGFP融合蛋白的诱导表达  29
      2.2.5.4 R7-EGFP融合蛋白的诱导表达  29
      2.2.5.5 重组蛋白表达菌体的收集与破碎  29
      2.2.5.6 重组蛋白表达产物的SDS-PAGE电泳  29-30
    2.2.6 重组蛋白的纯化方法  30-32
      2.2.6.1 目的融合蛋白的Ni亲和层析纯化方法  30
      2.2.6.2 目的融合蛋白的离子交换层析纯化方法  30-31
      2.2.6.3 目的融合蛋白的透析除盐和咪唑  31
      2.2.6.4 目的融合蛋白的变性与复性方法  31-32
  2.3 细胞实验常用的材料与仪器  32-34
    2.3.1 不同的肿瘤细胞株  32-33
    2.3.2 细胞实验所用试剂及配制  33-34
      2.3.2.1 细胞实验所用试剂  33
      2.3.2.2 细胞实验所用试剂的配制方法  33-34
    2.3.3 细胞实验所用的主要仪器  34
  2.4 细胞实验的主要方法  34-38
    2.4.1 细胞培养方法之复苏  34-35
    2.4.2 细胞培养之换液和传代  35
    2.4.3 细胞培养之冻存  35-36
    2.4.4 细胞凋亡检测实验之MTT法  36
    2.4.5 穿膜肽融合蛋白的穿膜实验  36-38
第三章结果与分析  38-71
  3.1 HBD-VP3融合蛋白的表达纯化及抑瘤活性分析  38-45
    3.1.1 HBD-VP3融合蛋白的表达鉴定  38
    3.1.2 HBD-VP3融合蛋白的纯化  38-44
      3.1.2.1 Ni柱亲和层析法纯化HBD-VP3融合蛋白  39-41
      3.1.2.2 用阳离子交换层析法纯化HBD-VP3  41-44
      3.1.2.3 HBD-VP3的包涵体变复性纯化  44
    3.1.3 HBD-VP3融合蛋白诱导HeLa细胞的凋亡  44-45
  3.2 TAT-VP3融合蛋白的表达纯化及其抑瘤活性的研究  45-48
    3.2.1 TAT-VP3融合蛋白的表达鉴定  45-46
    3.2.2 TAT-VP3融合蛋白的纯化  46-47
    3.2.3 MTT法TAT-VP3融合蛋白的抑瘤活性  47-48
  3.3 HBD-EGFP融合蛋白的表达鉴定及纯化  48-50
    3.3.1 HBD-EGFP融合蛋白的表达鉴定  48-49
    3.3.2 HBD-EGFP融合蛋白的纯化  49-50
  3.4 初步研究HBD-EGFP融合蛋白在不同细胞中的转导  50-59
    3.4.1 HBD-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中的穿膜活性  50-51
    3.4.2 HBD-EGFP融合蛋白在HepG2细胞中的穿膜活性  51-53
    3.4.3 HBD-EGFP融合蛋白在B16细胞中的穿膜活性  53-55
    3.4.4 HBD-EGFP融合蛋白在A549细胞中的穿膜活性  55-57
    3.4.5 HBD-EGFP融合蛋白在Bcap37细胞中的穿膜活性  57-59
  3.5 R7-EGFP融合蛋白的表达鉴定及纯化  59-60
    3.5.1 R7-EGFP融合蛋白的表达鉴定  59
    3.5.2 R7-EGFP融合蛋白的纯化  59-60
  3.6 初步研究R7-EGFP融合蛋白在不同细胞中的转导  60-67
    3.6.1 R7-EGFP融合蛋白在HeLa细胞中的穿膜活性  60-62
    3.6.2 R7-EGFP融合蛋白在HepG2细胞中的穿膜活性  62-63
    3.6.3 R7-EGFP融合蛋白在B16细胞中的穿膜活性  63-64
    3.6.4 R7-EGFP融合蛋白在A549细胞中的穿膜活性  64-66
    3.6.5 R7-EGFP融合蛋白在Bcap37细胞中的穿膜活性  66-67
  3.7 本章小结  67-71
    3.7.1 穿膜肽融合蛋白的表达  67-68
    3.7.2 穿膜肽融合蛋白的纯化  68-69
    3.7.3 凋亡素融合蛋白的药理活性  69
    3.7.4 EGFP融合蛋白的穿膜活性  69-71
第四章结论与展望  71-73
  4.1 结论  71-72
  4.2 展望  72-73
参考文献  73-79
研究生期间发表论文  79-80
致谢  80

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