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脂质体法转染小鼠体细胞的研究

作　者: 于建宁
导　师: 谭景和；王树迎
学　校: 山东农业大学
专　业: 基础兽医
关键词: 脂质体法 GFP 转染效率传代次数细胞种类细胞周期凋亡低温 Roseovitine
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

转染效率低是脂质体转染法存在的主要问题,制约了它的广泛应用。本文以绿色荧光蛋白(GFP)基因为报告基因研究了影响脂质体法转染小鼠体细胞效率的因素及转染对小鼠体细胞的影响,以期提高脂质体转染效率,为转基因克隆打下基础。首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体—质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响。在此优化的实验条件下,研究不同传代次数的MFFC对脂质体转染效率的影响及不同小鼠体细胞种类对脂质体转染效率的影响。接着,进行了细胞周期同步化方法的筛选并以筛选出的方法研究了细胞周期对脂质体转染效率的影响。结果如下: 1.在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×10~4个细胞,当脂质体(LipofectAMINE)41μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高,为30.7%。 2.用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%,3—6代为28%,到15代为7.2%。表明3—6代转染效率最高,随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低。 3.将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%。可见不同种类细胞的转染效率不同。细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关。 4.低温(5℃)的最好同步化结果是处理5h获得的G0/G1期同步化比例为74.1%,细胞凋亡比例3.5%。Roscovitine(Ros)的最好同步化方案是10μM作用24h,结果是G0/G1期84.2%,细胞凋亡比例9.4%。由于低温同步化程度较Ros低,而Ros对细胞的损伤较大,所以将两种同步化联合使用。结果表明,低温5h后37.5℃,10μM Ros再培养12h(LTR2)所获得的G0/G1期同步化比例为83.6%,细胞凋亡比例是3.6%。血清饥饿48h G0/G1期为79.7%,细胞凋亡比例为8.0%;秋水仙素与噻咹酯呐唑同步于G2/M期效率分别是34.7%和32.4%,细胞凋亡比例分别是25.3%和21.9%。因此,较好的同步化方法是低温5h、Ros10μM作用24h、LTR2和血清饥饿48h。同步方法解除后放开,每间隔4h取样检测,血清饥饿并没有获得高比例的S期和G2/M期,而其它三种方法均获得了高比例的S期和G2/M期。 5.采用筛选出的三种同步化方法,分别在G0/G1期、S期和G2/M期进行脂质体转染结果表明,在G2/M期转染时获得的表达GFP细胞数和克隆数最高。 6.从细胞形态看,转染后不如转染前的形态规则健康;转染后细胞的凋亡比例显著高于转染前(P<0.05);处于G0/G1期的比例显著增多(P<0.05);染色体倍性转染前与转染后差异不显著(P>0.05)。因此,综上所述,采用低温法、Ros法、LTR2细胞周期同步法均可获高的脂质体转染效率,其中LTR2要优于其它两种方法。

全文目录

中文摘要  4-5
英文摘要  5-7
1 前言  7-16
  1.1 生产转基因动物的方法  7-9
  1.2 外源基因导入动物体细胞的方法  9-10
  1.3 脂质体转染法  10-13
  1.4 细胞周期同步的方法  13-15
  1.5 本研究的实验目的与实验内容  15-16
2 材料与方法  16-23
  2.1 溶液的配制  16-17
  2.2 实验动物  17
  2.3 质粒的制备  17-18
  2.4 小鼠体细胞的培养  18-19
  2.5 MFFC的G418毒性检测  19
  2.6 脂质体法转染小鼠体细胞  19-20
  2.7 细胞周期同步化方法  20
  2.8 流式细胞计量术(FACS)检测细胞周期  20-21
  2.9 膜联蛋白V(Annexin V)—FITC与PI检测细胞凋亡  21
  2.10 染色体倍性分析  21-22
  2.11 统计分析  22-23
3 结果与分析  23-32
  3.1 脂质体量对转染效率的影响  23
  3.2 DNA量对转染效率的影响  23-24
  3.3 脂质体—DNA复合物暴露时间对转染效率的影响  24
  3.4 G418毒性检测  24
  3.5 细胞传代次数对转染效率的影响  24-25
  3.6 细胞种类对转染效率的影响  25-26
  3.7 细胞周期对转染效率的影响  26-30
  3.8 脂质体转染法对MFFC的影响  30-32
4 讨论  32-41
  4.1 脂质体量、DNA量和暴露时间对转染效率的影响  32
  4.2 细胞传代次数对脂质体转染效率的影响  32-33
  4.3 细胞种类对脂质体转染效率的影响  33
  4.4 MFFC的G418毒性检测  33
  4.5 细胞周期对转染效率的影响  33-39
  4.6 脂质体转染对 MFFC的影响  39-41
5 结论  41-42
参考文献  42-52
图版及图版说明  52-57
致谢  57-58
作者简介  58

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