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过量表达HmgD对果蝇发育的影响

作　者: 陈静
导　师: 王玉凤
学　校: 华中师范大学
专　业: 动物学
关键词: HmgD 过量表达果蝇发育血细胞化蛹
分类号: Q964
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

果蝇是一个重要的模式生物,已经在遗传和发育研究工作中作出了突出的贡献。不仅如此,在对果蝇与人类基因的比较中发现,三分之二引发人类疾病的基因(包括与癌症有关的基因)在果蝇中都存在类似的基因。HmgD基因编码果蝇中高迁移率组分蛋白(high mobility group proteins,HMGs)的同源物,在染色体位置上,该基因位于果蝇第二染色体右臂57F10位点。HMGD蛋白最早是由J.Bassuk等从果蝇胚胎细胞的核中分离得到,是果蝇中最主要的HMG蛋白。在结构上,HMGD含有典型的HMG框结构模式(HMG-box motif),和哺乳动物中HMGB亚家族蛋白最为接近。HMGD蛋白分子量小、但分布丰度较大,参与染色质的组装,被认为是染色质的“构建因子”(architectural factor)。HMGD蛋白通过结合DNA并使之发生弯曲,为组装核蛋白复合物提供方便。除此之外,HMGD还是一种母型蛋白,在卵巢和胚胎发育的中囊胚过渡之前丰度最大,对于最初的胚胎发育非常重要。有证据表明,在果蝇发育的中囊胚过渡之前,HMGD可以替代H1参与组装染色质,但HMGD参与形成的染色质结构较为松散,这对于胚胎发育早期的快速卵裂非常有利。但另有实验表明,HMGD和H1并没有相同的结合DNA的特征,而且HMGD不仅在雌性成体和早期胚胎中表达,在胚胎发育的后期以至整个发育时期都有表达。最近有研究结果表明,HmgD及其另外一种高度同源的HMG蛋白基因HmgZ的纯合突变体,可以发育至成体,且只表现出微小的表型缺陷。因此,HMGD可能不仅仅在果蝇早期胚胎发育过程中具有参与染色质的构建的功能,很可能在果蝇整个发育过程中具有其它重要的尚未可知的功能。本研究采用UAS-Gal4系统,通过功能获得性突变的方法研究了HmgD过量表达对果蝇发育的影响。结果表明,HmgD过量表达对果蝇胚胎发育的影响较弱,而对果蝇后期发育具有很大的影响。过量表达HmgD的胚胎死亡率较对照组高,但差异不显著,且有过量表达HmgD的胚胎仍然能够发育至成体。然而当HmgD在广泛表达的Gal4驱动子(Act-Gal4)的控制下过量表达时,子代出现大量死亡的现象。特别是用4个拷贝的转基因果蝇进行杂交时,后代中的突变型在三龄幼虫末期全部死亡;部分突变型幼虫体内长有黑色素瘤,而且其血细胞数量极显著地高于野生型。RT-PCR分析表明,突变幼虫中与血细胞增殖有关的Ras-MAPK途径和Toll途径被异常激活。另外过量表达2个拷贝该基因时,死亡的幼虫其发育全部停滞在三龄幼虫末期至预蛹(prepupa)阶段,即过量表达的幼虫不能正常化蛹。采用喂食蜕皮激素的方法,

全文目录

摘要  4-6
Abstract  6-10
前言  10-18
  1 高迁移率组分核小体蛋白(HMGs)简介  10-12
  2 HMGD的研究现状  12-14
  3 P因子及功能获得性UAS-Gal4系统概述  14-16
    3.1 P因子简介  14
    3.2 UAS-Gal4系统概述  14-16
  4 本研究的目的和意义  16-18
材料和方法  18-30
  1 实验材料  18-19
    1.1 所用到的果蝇品系及细菌菌株  18
    1.2 主要试剂  18
    1.3 主要仪器  18-19
  2 实验方法  19-30
    2.1 质粒构建  19
    2.2 纯化PCR产物  19-20
    2.3 E.coli感受态的制备  20
    2.4 转化  20
    2.5 质粒DNA的小量提取  20-21
    2.6 质粒的大量制备  21-22
    2.7 显微注射及转基因果蝇的检测  22
    2.8 提取果蝇基因组DNA  22-23
    2.9 胚胎死亡率统计  23
    2.10 胚胎表皮制片  23
    2.11 过量表达 HmgD突变体幼虫的挑选  23-24
    2.12 通过杂交使UASPHmgD在母型Gal4和ActGal4驱动子的控制下过量表达  24-25
    2.13 唾液腺染色体的制备  25
    2.14 血细胞计数  25
    2.15 蜕皮激素挽救实验(ecdysone feeding experiments)  25-26
    2.16 提取RNA  26-27
    2.17 血细胞增殖途径相关基因的RT-PCR检测  27
    2.18 蜕皮激素受体及其相关调控基因的RT-PCR检测  27-29
    2.19 数据分析  29-30
实验结果  30-42
  1 转基因果蝇的获得  30
  2 PCR验证转基因果蝇  30-31
  3 在母型Gal4驱动子控制下过量表达HmgD对果蝇发育的影响  31-33
    3.1 过量表达HmgD对果蝇胚胎表皮发育的影响  32-33
  4 在广泛表达的Gal4的驱动子(ActGal4)控制下过量表达HmgD对果蝇发育的影响  33-42
    4.1 杂交结果  33
    4.2 从唾液腺染色体方面检测过量表达HmgD对果蝇染色体的影响  33-34
    4.3 表达HmgD导致果蝇血细胞增生  34-35
    4.4 黑色素瘤的发生部位  35
    4.5 血细胞的检测  35-37
    4.6 过量表达HmgD对果蝇血细胞增殖途径的影响  37-38
    4.7 过量表达HmgD对果蝇幼虫发育过程中蜕皮及存活率的影响  38-39
    4.8 广泛过量表达HmgD导致幼虫不能正常化蛹  39-40
    4.9 喂食蜕皮激素不能挽救过量表达HmgD突变体幼虫正常化蛹  40-41
    4.10 过量表达HmgD对果蝇蜕皮激素受体途径的影响  41-42
讨论  42-45
  1 过量表达HmgD对果蝇胚胎发育的影响  42-43
  2 在广泛表达的Gal4的驱动子(ActGal4)控制下过量表达HmgD对果蝇发育的影响  43-45
    2.1 对血细胞的影响  43
    2.2 对化蛹的影响  43-45
参考文献  45-51
附录  51-52
致谢  52

过量表达HmgD对果蝇发育的影响

内容摘要

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