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根癌农杆菌介导LEAFY基因转化苹果的研究

作　者: 刘静
导　师: 徐继忠；邵建柱
学　校: 河北农业大学
专　业: 果树学
关键词: 苹果遗传转化 LEAFY 根癌农杆菌介导
分类号: S661.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
下　载: 201次
引　用: 4次
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内容摘要

苹果是世界上主要的果树树种之一,但其进入结果期较晚,影响了早期经济效益的获得,而通过生物技术将促进开花的基因导入苹果基因组内,促进其提早开花结果是一条十分重要的途径,将获得‘一劳永逸’的效果。本试验以M₂₆苹果砧木组培苗为试材,对影响苹果砧木茎段再生和根癌农杆菌介导苹果遗传转化的因素进行了系统研究,初步建立了M₂₆苹果砧木茎段的再生体系,优化了根癌农杆菌介导M₂₆苹果砧木的遗传转化体系,并以在拟南芥克隆的花分生组织特异性基因Leafy（LFY）基因为目的基因,利用农杆菌介导法转化嘎拉、富士、M₂₆,并通过GUS报告基因检测到外源GUS基因在再生抗性芽中的表达及聚合酶链式反应（PCR）检测技术初步证明获得了整合该基因的嘎拉苹果、富士苹果、M₂₆新种质,为遗传转化提供了分子生物学证据。本试验主要研究如下: 1.通过分析激素、暗培养、茎段部位、放置方式、继代时间等因素对M₂₆茎段再生的影响,确立了M₂₆茎段高效再生体系:选取继代培养20～25d的幼嫩茎段的上、中部茎段,以MS为基本培养基附加激素BA4.0mg/L,NAA0.1mg/L,以茎段形态学下端插入培养基,暗培养10d后光照培养60d,再生率和出芽数分别达到73%和4.15。 2.不同抗生素对再生枝条生根有一定的抑制作用,卡那霉素5mg/L抑制其生根,而头孢霉素500mg/L对生根抑制作用不大,Km浓度为5mg/L,Cef500mg/L是枝条生根的最佳抗生素浓度。 3.在M₂₆苹果转化体系中,头孢霉素浓度为500mg/L时适于作为M₂₆苹果砧木遗传转化的抑菌抗生素浓度。以OD₆₀₀为0.5的菌液侵染外植体3～5min较为适宜。共培养时培养基中添加20mg/L的乙酰丁香酮和3d的共培养有助于提高M₂₆转化外植体的GUS阳性率,同时也保证了较高外植体再生率。共培养后延迟2～3d进行筛选有利于提高根癌农杆菌的转化的再生率和外植体的GUS的阳性率。本试验优化的根癌农杆菌介导苹果遗传转化再生体系为:以含BA4.0mg/L,NAA0.2mg/L的MS为培养基,以M₂₆叶片为外植体材料,经根癌农杆菌侵染3～5min,黑暗共培养3d,共培养培养基中含20mg/L的AS,用头孢霉素脱菌培养3d,再进行卡那霉素30mg/L选择压筛选,经过7～8次的继代筛选,获得抗性芽、抗性苗,并进行扩繁、生根。 4.不同的遗传转化体系其转化效率有很大的不同。与叶片再生体系相比,以茎段为外植体进行转化,转化茎段经GUS组织化学染色检测,其GUS的瞬时表达率为13.33%,表达强度较弱,仅在切口和基部有少量表达;且获得抗性芽较难,抗性芽率仅为0.2%,经GUS检测、PCR检测均呈假阳性。 5.通过优化根癌农杆菌介导苹果遗传转化体系,以LFY基因为目的基因进行转化嘎拉、富士、M₂₆的研究,对获得的抗性芽进行了GUS组织化学染色、PCR检测,证实外源基因已经整合到转化抗性芽的基因组中,获得了转LFY基因的嘎拉苹果、富士苹果、M₂₆新种质。

全文目录

1 引言  11-20
  1.1 根癌农杆菌介导苹果遗传转化的研究  11
  1.2 高效离体再生系统的影响因素的研究  11-14
    1.2.1 基因型  12-13
    1.2.2 外植体生理状态  13-14
    1.2.3 培养基中激素配比  14
    1.2.4 基本培养基类型  14
    1.2.5 前期暗处理  14
    1.2.6 抗生素  14
  1.3 高效遗传转化系统的影响因素  14-17
    1.3.1 基因型  14-15
    1.3.2 菌株类型  15
    1.3.3 菌液浓度及外植体在菌液中的浸泡时间  15
    1.3.4 酚类物质  15
    1.3.5 共培养时间、叶片放置方向及切割方式  15-16
    1.3.6 预培养、脱菌培养和选择培养  16-17
  1.4 植物开花相关基因的研究  17-18
    1.4.1 同源异型基因  17
    1.4.2 花分生组织决定基因  17-18
    1.4.3 开花时间决定基因  18
    1.4.4 开花基因转化植物的研究现状  18
  1.5 本研究的目的、意义  18-20
2 材料与方法  20-28
  2.1 材料  20-21
    2.1.1 植物材料  20
    2.1.2 菌株  20-21
    2.1.3 培养基与培养液  21
  2.2 试验方法  21-26
    2.2.1 苹果茎段再生体系的建立  21-22
    2.2.2 苹果遗传转化体系的优化  22-24
    2.2.3 转基因抗性芽的检测  24-26
  2.3 试剂与试剂溶液的配制  26-27
    2.3.1 试剂  26
    2.3.2 主要试剂溶液的配制  26-27
  2.4 结果调查统计指标  27-28
    2.4.1 茎段再生率的统计方法  27
    2.4.2 转化效率的评价指标  27-28
3 结果与分析  28-42
  3.1 苹果茎段再生体系的建立  28-32
    3.1.1 不同激素浓度对茎段再生的影响  28-29
    3.1.2 暗培养对茎段再生的影响  29
    3.1.3 茎段部位对再生的影响  29-30
    3.1.4 茎段放置方式对再生的影响  30
    3.1.5 试管苗的继代培养时间对茎段再生的影响  30-31
    3.1.6 不同基因型对茎段再生的影响  31
    3.1.7 再生枝条的生根试验  31-32
  3.2 苹果遗传转化体系的优化  32-37
    3.2.1 Km选择压的确定  32
    3.2.2 农杆菌侵染浓度的确定  32-33
    3.2.3 农杆菌侵染时间的确定  33
    3.2.4 共培养时间对 M_(26)叶片转化的影响  33-34
    3.2.5 预培养时间对 M_(26)叶片转化的影响  34
    3.2.6 延时筛选对 M_(26)叶片转化再生率的影响  34-35
    3.2.7 乙酰丁香酮(AS)浓度对 M_(26)叶片转化的影响  35-36
    3.2.8 抑菌抗生素对 M_(26)叶片转化再生率的影响  36
    3.2.9 抗生素对再生枝条生根的影响  36
    3.2.10 共培养温度对 M_(26)叶片转化的影响  36-37
    3.2.11 茎段遗传转化效率的比较  37
  3.3 苹果转 LFY基因抗性芽的获得及检测  37-42
    3.3.1 M_(26)转 LFY基因抗性芽的获得及检测  37-39
    3.3.2 转 LFY基因富士、嘎拉抗性芽的获得及检测  39-42
4 讨论  42-45
  4.1 影响苹果茎段再生的因素  42
  4.2 影响遗传转化的因素  42-44
    4.2.1 选择压的确定  42-43
    4.2.2 侵染浓度及侵染时间  43
    4.2.3 预培养时间  43
    4.2.4 脱菌培养  43-44
    4.2.5 AS在遗传转化中的作用  44
  4.3 茎段遗传转化体系  44-45
5 结论  45-46
参考文献  46-53
图版  53-55
在读期间发表的学术论文  55-56
作者简历  56-57
致谢  57-58
附发表文章  58-63

根癌农杆菌介导LEAFY基因转化苹果的研究

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