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仿生鲶鱼抗菌肽的克隆、表达与活性检测

作　者: 谢慧
导　师: 王武
学　校: 江南大学
专　业: 生物化工
关键词: 抗菌肽鲶鱼序列设计重组质粒大肠杆菌低温诱导离子交换层析
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

抗菌肽是由微生物、植物、动物及人体等产生的具有抗菌能力的短肽类物质,不仅抗菌活性强、抗菌谱广、合成和杀菌速度快,而且不易诱导抗药菌株的产生,有望成为新一代的抗菌制剂。据报道,受伤鲶鱼parasilurus asotus的上皮组织分泌一种有广谱抗菌性却无溶血活性的抗菌肽—Parasin I,研究发现和其它抗菌肽相比,其抗菌能力更强,对革兰氏阴性菌,革兰氏阳性菌,真菌均有抑制效果。抗菌肽Parasin I是组蛋白裂解产物,不可能通过cDNA方法从鲶鱼组织细胞中得到基因。本研究采取仿生设计和人工合成的技术路线,人工合成仿生鲶鱼抗菌肽DNA序列,经PCR扩增后得到带有不同限制性酶切位点的序列XH1、XH2、XH3。将此基因克隆至载体pGEX-5X-3,成功构建了三元序列重组质粒。测序验证后转化大肠杆菌BL21(DE3),于37℃经IPTG诱导,融合蛋白以包涵体形式高效表达。经SDS-PAGE谱带黑度扫描分析表明,融合蛋白可达细菌全蛋白总量的30%。采用低温诱导的方法,使目的融合蛋白在细胞内减速转译,形成可溶性蛋白。确定最佳诱导条件为:温度20℃,诱导10小时。经过超声处理细胞,盐析,CM-52阳离子交换柱等提取、分离、纯化,得到所期望的有抗菌活性的仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A。已提取纯化的目的肽段对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母等微生物进行抑菌试验,结果表明,对大肠杆菌、特别是革兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌均有抑制活性,其中枯草芽孢杆菌对PaH2A最为敏感。

全文目录

中文摘要  7-8
英文摘要  8-9
第一章绪论  9-19
  1.1 抗菌肽的分类、作用机理和特点  9-10
    1.1.1 抗菌肽的特点  9
    1.1.2 抗菌肽的类别  9-10
    1.1.3 抗菌肽的作用机理及作用特点  10
  1.2 抗菌肽的制备方法  10-12
    1.2.1 提取法  10-11
    1.2.2 固相合成法  11
    1.2.3 基因工程表达  11-12
  1.3 抗菌肽应用  12-16
    1.3.1 在医药工业中的应用  12-15
      1.3.1.1 抗细菌作用  12-13
      1.3.1.2 抗真菌作用  13-14
      1.3.1.3 抗病毒作用  14
      1.3.1.4 抗寄生虫  14
      1.3.1.5 抗肿瘤  14-15
    1.3.2 在食品工业中的应用  15
    1.3.3 饲料工业  15-16
  1.4 鲇鱼抗菌肽  16-17
    1.4.1 分子量和氨基酸序列分析  16
    1.4.2 抗菌和溶血现象  16-17
  1.5 课题研究意义及内容  17-19
第二章仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 编码序列的设计与克隆  19-31
  2.1 材料与方法  19-23
    2.1.1 实验材料  19-20
      2.1.1.1 菌株及质粒  19
      2.1.1.2 酶及主要试剂  19-20
      2.1.1.3 主要仪器设备  20
      2.1.1.4 培养基和培养条件  20
    2.1.2 实验方法  20-23
      2.1.2.1 目的基因的扩增  20-21
      2.1.2.2 回收后的PCR 产物的纯化  21
      2.1.2.3 限制性内切酶切作用与连接  21
      2.1.2.4 感受态细胞的制备  21-22
      2.1.2.5 一元表达载体的构建  22
      2.1.2.6 三元表达载体的构建  22
      2.1.2.7 重组载体的验证  22
      2.1.2.8 测序  22
      2.1.2.9 融合蛋白的分子量鉴定  22
      2.1.2.10 质粒的稳定性检验  22-23
  2.2 结果与讨论  23-29
    2.2.1 目的序列与相应引物的设计  23-24
    2.2.2 序列XH1、XH2、XH3的PCR扩增结果  24
    2.2.3 重组质粒的构建  24
    2.2.4 重组质粒的连接与转化  24-25
    2.2.5 重组质粒的鉴定  25-26
    2.2.6 测序结果分析  26-27
    2.2.7 融合蛋白的初步表达  27
    2.2.8 融合蛋白在细胞内的存在形式  27-28
    2.2.9 质粒的稳定性检验  28-29
  2.3 本章小结  29-31
第三章仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 低温诱导及提取与纯化  31-43
  3.1 材料与方法  31-33
    3.1.1 实验材料  31-32
      3.1.1.1 菌种  31
      3.1.1.2 主要试剂  31
      3.1.1.3 主要仪器  31-32
    3.1.2 实验方法  32-33
      3.1.2.1 蛋白含量测定方法  32
      3.1.2.2 SDS-PAGE 凝胶电泳  32
      3.1.2.3 菌体破碎前的预处理  32
      3.1.2.4 超声波法破碎菌体  32
      3.1.2.5 盐析  32-33
      3.1.2.6 融合蛋白的CNBr 切割  33
      3.1.2.7 离子交换柱的制备及离子交换柱  33
  3.2 结果与讨论  33-42
    3.2.1 低温下重组菌诱导条件的研究  33-36
      3.2.1.1 不同诱导温度对融合蛋白在胞内存在形式的影响  33-35
      3.2.1.2 低温条件下不同时间融合蛋白的表达量  35-36
    3.2.2 粗产物的预处理  36-41
      3.2.2.1 蛋白定量  36
      3.2.2.2 超声波对细胞破碎的研究  36-39
        3.2.2.2.1 破碎时间对菌体破碎效果的影响  36-37
        3.2.2.2.2 菌悬液浓度对菌体破碎效果的影响  37-38
        3.2.2.2.3 菌悬液体积对破碎效果的影响  38-39
      3.2.2.3 融合蛋白的初步分离  39
      3.2.2.4 PaH2A 与融合蛋白肽段的分割  39-41
    3.2.3 PaH2A的初步纯化分离  41-42
  3.3 本章小结  42-43
第四章仿生鲶鱼抗菌肽PaH2A 抗菌活性的测定  43-50
  4.1 材料与方法  43-45
    4.1.1 实验材料  43-44
      4.1.1.1 检测菌种  43
      4.1.1.2 主要仪器  43
      4.1.1.3 检测培养基  43-44
      4.1.1.4 指示菌悬液的制备  44
    4.1.2 实验方法  44-45
      4.1.2.1 双层平板的制备  44
      4.1.2.2 Amp标准溶液  44
      4.1.2.3 样品的制备  44
      4.1.2.4 空白对照样品的制备  44-45
  4.2 实验结果  45-49
    4.2.1 PaH2A 对大肠杆菌 BL21(DE3)的抑制  45-46
      4.2.1.1 标准曲线的绘制  45
      4.2.1.2 PaH2A 对大肠杆菌的活性检测  45-46
    4.2.2 PaH2A 对枯草芽孢杆菌的抑制  46-47
      4.2.2.1 标准曲线的绘制  46
      4.2.2.2 PaH2A 对枯草芽孢杆菌的活性检测  46-47
    4.2.3 PaH2A 对金黄色葡萄球菌的抑制  47-48
      4.2.3.1 标准曲线的绘制  47-48
      4.2.3.2 目的蛋白对金黄色葡萄球菌的活性检测  48
    4.2.4 PaH2A 对几种不同菌株抑制效果的比较  48-49
  4.3 本章小结  49-50
结论与展望  50-51
参考文献  51-54
硕士研究生期间在科学技术期刊上发表的论文  54-55
致谢  55-57
附录  57-59

仿生鲶鱼抗菌肽的克隆、表达与活性检测

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