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精氨酸脱亚胺酶的分泌型表达研究

作　者: 李娜
导　师: 倪晔
学　校: 江南大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 精氨酸脱亚胺酶 大肠杆菌 毕赤酵母 分泌表达 抗癌
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


精氨酸脱亚胺酶(ADI；EC 3.4.3.6)是一种精氨酸降解酶,催化精氨酸生成瓜氨酸。ADI广泛存在于细菌、古细菌、厌氧真核生物中,它是一种治疗精氨酸缺陷型肿瘤(如肝细胞癌、黑素瘤)的药物。本研究室前期从环境中筛选获得一株ADI高产菌株,经鉴定为Pseudomonas plecoglossicida CGMCC2039。前期研究将该变形假单胞菌来源的ADI在大肠杆菌BL21中进行胞内表达,存在包涵体多、纯化分离步骤较繁琐等缺陷。为简化分离纯化并提高该酶作为人类抗癌药的应用潜力,本论文将变性假单胞菌来源的ADI在毕赤酵母和大肠杆菌中分别进行分泌型表达。将来源于变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arcA根据毕赤酵母的密码子偏好性进行优化,然后将优化后的基因yh-ADI克隆至表达载体pPIC9K。成功构建重组表达载体pPIC9K-yh-ADI。毕赤酵母转化子经96孔板传代培养后,再进行6418筛选获得多拷贝重组子。对酵母重组子诱导条件的初步优化,得到酵母重组子在1%甲醇诱导72 h后ADI活性最高,GS115/pPIC9K-yh-ADI酶活29.0mU/mL。同时为了获得高表达的ADI,还研究了ADI在大肠杆菌中的分泌表达。将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢB中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F’后进行诱导表达,分别考察了诱导物L-arabinose浓度、诱导温度及诱导时间对重组蛋白表达的影响,确定最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002%(w/v),25℃下诱导5 h,全细胞的酶活为68 mU/mL。采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kDa,与理论结果一致。通过ADI在大肠杆菌及毕赤酵母中的分泌表达,得到和天然酶具有相同生物学活性的重组ADI,首次实现原核生物来源的ADI在真核表达系统中的表达。为进一步获得分泌型的重组ADI以及ADI-HSA的融合表达和抗肿瘤研究奠定了理论基础,将有助于推动精氨酸脱亚胺酶更广泛、更深入的应用。

全文目录


摘要  3-4
Abstract  4-5
目录  5-7
第一章 绪论  7-17
  1.1 精氨酸脱亚胺酶  7-12
    1.1.1 精氨酸脱亚胺酶简介  7
    1.1.2 精氨酸脱亚胺酶的结构研究  7-9
    1.1.3 精氨酸脱亚胺酶的主要用途  9
    1.1.4 精氨酸脱亚胺酶的研究进展  9-12
  1.2 毕赤酵母表达系统  12-15
    1.2.1 毕赤酵母的生物学特征  12
    1.2.2 毕赤酵母的表达菌株  12-13
    1.2.3 毕赤酵母的表达载体  13-14
    1.2.4 影响外源蛋白在毕赤酵母中表达的因素  14-15
  1.3 大肠杆菌分泌表达系统  15
  1.4 本课题研究背景、意义和课题来源  15-16
  1.5 本课题研究思路和研究内容  16-17
第二章 材料与方法  17-27
  2.1 材料  17-19
    2.1.1 菌种与载体  17
    2.1.2 主要试剂  17
    2.1.3 引物  17-18
    2.1.4 主要设备  18
    2.1.5 主要培养基和溶液  18-19
  2.2 方法  19-27
    2.2.1 精氨酸脱亚胺酶在毕赤酵母中的分泌表达  19-24
    2.2.2 精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的分泌表达  24-27
第三章 结果与讨论  27-44
  3.1 精氨酸脱亚胺酶在毕赤酵母中的分泌表达  27-37
    3.1.1 目的基因的优化与克隆  27-29
    3.1.2 重组载体pPIC9K-yh-ADI的构建  29-30
    3.1.3 表达载体的线性化与电转化毕赤酵母  30-32
    3.1.4 基因多拷贝重组子的筛选  32-33
    3.1.5 酵母重组子的鉴定  33-35
    3.1.7 重组子的诱导表达及发酵条件的初优化  35-36
    3.1.8 表达产物的检测  36-37
  3.2 精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的分泌表达  37-44
    3.2.1 PCR扩增及T-nx-ADI的构建  37-38
    3.2.2 重组载体pBAD-nx-ADI的构建  38
    3.2.3 重组菌E. coli TOP10F'/pBAD-nx-ADI的诱导表达及诱导条件的初步优化  38-42
    3.2.4 表达产物的初分离及酶活测定  42-44
主要结论与展望  44-46
  1 主要结论  44
  2 展望  44-46
致谢  46-47
参考文献  47-51
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  51

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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