学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

软化芽孢杆菌α-环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中胞外分泌的优化

作　者: 李彬
导　师: 吴敬
学　校: 江南大学
专　业: 发酵工程
关键词: α-环糊精葡萄糖基转移酶 软化芽孢杆菌 大肠杆菌 胞外分泌 细菌素释放蛋白
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 63次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载
 

内容摘要


环糊精葡萄糖基转移酶(简称CGT酶,EC 2.4.1.19)能够通过分子内转糖基化反应转化淀粉及相关基质合成环糊精。随着环糊精在食品、医药等领域的应用越来越广,CGT酶已成为当今研究的热点。本实验室前期的研究工作中,成功实现了Paenibacillus maceransα-环糊精葡萄糖基转移酶(α-CGT酶)在大肠杆菌中的胞外分泌。为了进一步提高重组α-CGT酶在大肠杆菌中的高效表达,本研究从信号肽的优化、细菌素释放蛋白的共表达和向培养基中添加培养基添加剂促进软化芽孢杆菌P. maceransα-CGT酶在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中的胞外分泌。主要研究结果如下:(1)通过常规PCR和重叠PCR获得了大肠杆菌中常用于外源重组蛋白分泌表达的信号肽基因,将信号肽融合到α-CGT酶成熟蛋白的N端,并在E. coli BL21(DE3)中实现了表达。考察了OmpA、PelB、OmpT和Endoxylanase四个信号肽对重组α-CGT酶在大肠杆菌中胞外分泌的影响。在相同的发酵条件下,OmpA信号肽介导的重组α-CGT酶分泌效果最好,发酵72小时,胞外酶活可达32 U/mL,分别是PelB、OmpT介导效率的2.4倍和4.3倍。Endoxylanase信号肽介导的重组α-CGT酶分泌效果相对较差,在胞外只能检测到很低的α-CGT酶活性,大量α-CGT酶以不可溶性的包涵体形式存在。(2)采用重叠PCR获得经过改造的BRP蛋白Lpp-BRP的编码基因,将其克隆到pSTV 28载体中,与重组α-CGT酶的表达质粒一起共转化E. coli BL21(DE3)。考察了BRP蛋白的共表达对目的蛋白胞外分泌的影响。结果显示在现有的表达系统中,BRP的共表达对重组α-CGT酶的胞外分泌几乎没有促进作用。(3)考察了不同培养基添加剂如甘氨酸、SDS、Tween-80和Triton X-100等对重组α-CGT酶分泌表达的影响。实验结果发现甘氨酸和Triton X-100对重组α-CGT酶的胞外分泌具有明显的促进作用。在发酵15 h时添加0.7 %甘氨酸,发酵48 h时上清液中酶活可达30 U/mL;在发酵初始时添加0.2 %Triton X-100,发酵48 h时胞外酶活可达28.9 U/mL,分别比对照组提高了9.7倍和9.3倍。(4)在单因素实验的基础上,采用两因素三水平部分因子设计实验对甘氨酸和Triton X-100叠加作用的添加浓度进行了优化。当培养基中添加0.5%甘氨酸和0.5%Triton X-100时,促进作用最明显;发酵48 h,胞外酶活可达到48 U/mL,是不含任何添加剂对照组生产强度的20倍,比野生菌P. macerans JFB05-01在较优条件下的产酶生产强度高95倍。(5)通过阴离子交换和疏水色谱两步纯化了来自含有添加剂(0.5%甘氨酸和0.5%Triton X-100)和不添加任何添加剂时发酵上清液中的α-CGT酶,测定两种来源的α-CGT酶的比活,分别为195.1 U/mg和199.8 U/mg,无明显差异。因此,甘氨酸和Triton X-100的添加对重组α-CGT酶的折叠几乎没有影响。(6)分别采用ONPG和NPN作为分子探针,分析了不同培养条件下大肠杆菌细胞内外膜的通透性。在最优培养条件下,细胞内外膜的通透性分别是对照组的9倍和3倍。细胞膜通透性的增大可能在强化α-CGT酶的胞外分泌过程中起着重要作用,具体的机理还有待进一步研究。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章 绪论  10-20
  1.1 环糊精概述  10-11
    1.1.1 环糊精的组成与结构  10
    1.1.2 环糊精的功能与应用  10-11
  1.2 环糊精葡萄糖基转移酶（CGT 酶）概述  11-13
    1.2.1 CGT 酶的结构  11
    1.2.2 CGT 酶的功能  11-12
    1.2.3 CGT 酶在工业上的应用  12
    1.2.4 CGT 酶的产物特异性  12-13
  1.3 CGT 酶在基因工程菌中的发酵生产  13-17
    1.3.1 CGT 酶在基因工程菌中的发酵生产现状  13-14
    1.3.2 大肠杆菌重组蛋白表达系统  14-15
    1.3.3 大肠杆菌的分泌表达  15-16
    1.3.4 大肠杆菌的胞外分泌  16-17
  1.4 立题依据及意义  17
  1.5 本论文主要研究内容  17-20
第二章 实验材料与方法  20-30
  2.1 质粒和菌株  20
  2.2 试剂与仪器  20-21
    2.2.1 主要试剂  20
    2.2.2 主要仪器  20-21
  2.3 培养方法  21
    2.3.1 培养基  21
    2.3.2 种子培养  21
    2.3.3 摇瓶发酵  21
  2.4 分子生物学操作  21-27
    2.4.1 信号肽基因的获得  21-22
    2.4.2 细菌素释放蛋白（BRP）基因的获得  22
    2.4.3 定点突变  22-23
    2.4.4 胶回收目的片段  23-24
    2.4.5 克隆载体构建  24
    2.4.6 E. coli 化学感受态细胞的制备  24
    2.4.7 热激转化  24
    2.4.8 E. coli 电转化感受态细胞的制备  24-25
    2.4.9 电击转化  25
    2.4.10 质粒DNA 的提取  25-26
    2.4.11 质粒DNA 的酶切验证  26
    2.4.12 DNA 琼脂糖凝胶电泳  26
    2.4.13 目的基因与表达载体的连接  26-27
  2.5 分析方法  27-30
    2.5.1 菌体干重的测定  27
    2.5.2 E. coli 细胞中不同组分α-CGT 酶的制备  27
    2.5.3 α-CGT 酶环化活力的测定  27
    2.5.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测表达产物  27-28
    2.5.5 大肠杆菌细胞内膜通透性的测定  28
    2.5.6 大肠杆菌细胞外膜通透性的测定  28
    2.5.7 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)活力的测定  28
    2.5.8 蛋白质浓度的测定  28-29
    2.5.9 重组α-CGT 酶的纯化  29-30
第三章 结果与讨论  30-56
  3.1 信号肽对重组α-CGT 酶胞外分泌的影响  30-38
    3.1.1 信号肽基因的克隆  30-33
    3.1.2 信号肽对α-CGT 酶胞外分泌的影响  33-34
    3.1.3 IPTG 浓度对α-CGT 酶胞外分泌的影响  34-35
    3.1.4 重组α-CGT 酶在大肠杆菌中的分布  35-36
    3.1.5 分析与讨论  36-38
  3.2 细菌素释放蛋白的共表达对重组α-CGT 酶胞外分泌的影响  38-46
    3.2.1 细菌素释放蛋白基因的克隆  38-41
    3.2.2 BRP 蛋白表达载体的定点突变改造  41-42
    3.2.3 细菌素释放蛋白(BRP)与α-CGT 酶基因的共表达  42-43
    3.2.4 IPTG 浓度和诱导温度对共表达的影响  43-45
    3.2.5 BRP 蛋白共表达前后对重组α-CGT 酶胞外分泌的影响  45-46
  3.3 培养基添加剂对α-CGT 酶胞外分泌的促进作用  46-56
    3.3.1 不同培养基添加剂对重组α-CGT 酶胞外分泌的影响  46-47
    3.3.2 甘氨酸对α-CGT 酶胞外分泌的影响  47-48
    3.3.3 Triton X-100 对α-CGT 酶胞外分泌的影响  48-49
    3.3.4 甘氨酸和Triton X-100 协同作用对α-CGT 酶胞外分泌的影响  49-51
    3.3.5 重组α-CGT 酶的纯化及比活分析  51-53
    3.3.6 不同培养条件下α-CGT 酶在细胞中的分布  53-54
    3.3.7 甘氨酸和Triton X-100 强化α-CGT 酶胞外分泌的潜在作用机理  54-56
第四章 结论与展望  56-58
  4.1 结论  56-57
  4.2 展望  57-58
致谢  58-60
参考文献  60-67
附录:作者在攻读硕士学位期间发表的论文  67-68

相似论文

  1. 大肠杆菌和沙门氏菌定量检测方法的建立和试剂盒的研制,S154.3
  2. 军曹鱼生长激素基因（GH）的克隆和表达,Q786
  3. 传染性法氏囊病病毒VP2基因的表达与单克隆抗体的制备,S852.65
  4. 鸡源禽致病性大肠杆菌分离鉴定及其毒力相关基因分布特征分析,S852.61
  5. 腐生葡萄球菌M36耐有机溶剂脂肪酶基因的克隆与表达,Q78
  6. 灵芝异戊二烯焦磷酸异构酶基因的克隆及其表达特性的研究,S567.31
  7. 江苏省动物源大肠杆菌耐药性的监测及动物源细菌耐药性监测的探讨,S854
  8. 微生物转化合成2’-脱氧腺苷,TQ464.3
  9. 结核分枝杆菌Rv3807c基因的克隆、表达及功能鉴定,R246
  10. 基于恒压式超高压技术的黄瓜汁杀菌与保鲜研究,TS255.5
  11. 脉冲式超高压处理对食品的杀菌和贮藏期品质的影响,TS255.36
  12. 银翘散及金银花提取物对大肠杆菌的体外抑制作用研究,S853.7
  13. 四种氧化物纳米材料在自然沉降过程中对大肠杆菌毒性研究,R318.08
  14. 凉拌菜大肠杆菌O_（157）：H_7污染状况及风险评估,R155.5
  15. 链霉亲和素的原核表达及复性,Q78
  16. 大肠杆菌磷酸烯醇式丙酮酸—糖磷酸转移酶系统（PTS系统）分子改造及敲除菌性能测定,Q78
  17. 重组α-环糊精葡萄糖基转移酶酶制剂稳定性的研究,Q814
  18. 济宁地区鸡源致病性大肠杆菌分离鉴定与耐药性分析,S852.61
  19. 大肠杆菌等致病菌的近红外光谱检测方法研究,R378
  20. 重庆市猪源大肠杆菌对β-内酰胺类药物耐药性的研究,S852.61
  21. 应用生物功能化纳米颗粒检测大肠杆菌O157：H7的研究,R155

中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 酶制剂（酵素）
© 2012 www.xueweilunwen.com