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草菇低温诱导蛋白的分离纯化及其酶解片段的N端序列分析

作　者: 戴志刚
导　师: 潘迎捷
学　校: 南京农业大学
专　业: 微生物学
关键词: 草菇低温诱导蛋白分离纯化 N端氨基酸序列
分类号: S646.13
类　型: 硕士论文
年　份: 2003年
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内容摘要

草菇(Volvariella volvacea)起源于中国，迄今已有300多年的栽培历史。草菇是典型的热带高温型食用菌，菌丝对低温的抵抗力差，对环境条件的变化尤其是温度的变化很敏感。与大多数食用菌相比，草菇存在着冷害，即在4℃的低温条件下保存，菌丝会发生自溶而导致菌种死亡和子实体发软、液化直至腐烂。这给草菇的菌种保存和产后保鲜带来了极大的困难。对草菇低温自溶现象的探索已成为一个重要的研究热点，在分子水平上已经有了一些研究工作。本文从蛋白这一角度出发，通过对草菇进行低温处理后蛋白表达的变化来分离纯化和鉴定与其相关的低温诱导蛋白。主要研究结果如下： 1．运用硫酸铵和聚丙烯酰胺制备电泳相结合的技术，进行了草菇低温诱导蛋白的分离纯化，蛋白纯度达到氨基酸测序的要求(大于95％)。 2．经硫酸铵分级沉淀后，采用聚丙烯酰胺制备电泳技术，以未经低温处理的草菇菌丝体蛋白样品为对照，分离、纯化得到了三种新的草菇低温诱导蛋白，分别命名为CspDZG1、CspDZG2、CspDZG3。 3．等电聚焦电泳方法分析了三种蛋白的等电点，分别为：3.7，4.4和4.4。 4．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果表明，CspDZG1、CspDZG2由一条多肽组成，分子量分别为56KD，54.5KD；CspDZG3由两个亚基组成，分子量分别为54.5KD，68KD。 5．经S. aureus V8蛋白酶酶解后，分别测定了N端氨基酸序列。本研究中，通过对草菇可溶性蛋白组分的分析，发现草菇在低温胁迫下有新的可溶性蛋白质产生。说明草菇在低温刺激下，产生了特异的低温诱导应答的产物，即低温诱导蛋白。这一结果与陈明杰等在低温条件下草菇有新的mRNA出现的研究结果是相适应的。

全文目录

摘要  5-7
ABSTRACT  7-9
文献综述  9-23
  1 草菇简介  9-14
    1.1 草菇栽培的起源与发展  9-10
    1.2 草菇的营养价值  10-11
    1.3 草菇的栽培  11
    1.4 草菇的研究现状  11-14
  2 动物低温诱导蛋白的研究  14-16
    2.1 动物低温诱导蛋白的发现  14-15
    2.2 动物低温诱导蛋白的转基因研究及其应用  15-16
  3 植物低温诱导蛋白的研究  16-20
    3.1 植物低温诱导蛋白的发现  16-17
    3.2 植物低温诱导蛋白的抗寒机理及其分子基础  17-20
  4 微生物低温诱导蛋白的研究  20-23
    4.1 细菌低温诱导蛋白的研究进展  20-22
    4.2 真菌低温诱导蛋白的研究  22-23
研究目标  23-24
材料与方法(MATERIALS AND METHODS)  24-37
  1 试验材料  24-27
    1.1 试验材料  24
    1.2 供试培养基  24
    1.3 试验试剂  24-26
    1.4 使用仪器  26-27
  2 试验方法  27-37
    2.1 草菇菌丝体培养及低温诱导方法  27
    2.2 草菇低温诱导蛋白粗样品的制备  27-28
    2.3 电泳技术分离纯化草菇低温诱导蛋白  28-30
    2.4 草菇低温诱导蛋白的鉴定  30-32
    2.5 蛋白质N端序列分析  32-33
    2.6 草菇低温诱导基因片段的克隆  33-37
结果与分析(RESULTS AND ANALYSES)  37-45
  1 草菇低温诱导处理  37
  2 草菇菌丝体可溶性蛋白的提取与(NH_4)_2SO_4分级沉淀后可溶性蛋白的比较  37-38
  3 聚丙烯酰胺制备型电泳分离、纯化草菇低温诱导蛋白  38-40
  4 草菇低温诱导蛋白的鉴定  40-42
    4.1 草菇低温诱导蛋白的等电点测定  40-41
    4.2 草菇低温诱导蛋白分子量的测定  41-42
  5 蛋白质N端序列分析  42-44
  6 草菇低温诱导基因片段的克隆  44-45
讨论(DISCUSSIONS)  45-48
  1 草菇低温诱导蛋白的分离纯化方法的建立  45-46
  2 草菇低温诱导蛋白在低温条件下的反应  46
  3 蛋白质氨基酸序列分析  46-47
  4 草菇低温诱导蛋白与其它低温诱导蛋白的比较  47-48
结论  48-49
参考文献(LITERATURES)  49-57
缩写(ABBREVIATIONS)  57-58
致谢  58

草菇低温诱导蛋白的分离纯化及其酶解片段的N端序列分析

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