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甘薯品种徐薯18遗传转化体系的研究

作　者: 李强
导　师: 刘庆昌；马代夫
学　校: 中国农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 甘薯徐薯18 胚性悬浮细胞根癌农杆菌介导转基因植株
分类号: S531
类　型: 硕士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本研究以甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞为受体,研究影响农杆菌介导法遗传转化效率的诸条件,以建立徐薯18的遗传转化体系。所用菌株为根癌农杆菌EHA101,该菌株携带的质粒pROA93上含有新霉素磷酸转移酶基因（NPT Ⅱ）和β-葡萄糖苷酸酶基因（GUS）。通过对菌液浓度、悬浮细胞继代培养时间、甘露醇高渗处理、共培养时间、共培养培养基中的AgNO₃和乙酰丁香酮（AS）浓度、选择压等因素的系统研究,确定了徐薯18胚性悬浮细胞遗传转化的适宜条件。结果表明,继代培养3d的胚性悬浮细胞最适合转化;菌液浓度OD_600nm=0.1～0.9对遗传转化效率没有明显影响;用0.45mol/L甘露醇预处理胚性悬浮细胞60min可以显著提高转化效率;共培养2-4d,转化效率高,并且转化愈伤组织状态好;在共培养培养基中添加20μmol/LAgNO3可以显著提高转化效率;在共培养培养基中添加100μmol/LAS可以显著提高转化效率。利用适宜的转化条件转化徐薯18胚性悬浮细胞,GUS瞬时表达率达90.2%。用含有100mg/LCarb、50mg/LKan和2.0mg/L2,4-D的MS培养基进行筛选培养,由1538个细胞团获得676个抗性愈伤组织。抗性愈伤组织经GUS检测,稳定表达率平均达94.4%。将获得的抗性愈伤组织转移到添加100mg/LCarb、25mg/LKan和1.0mg/LABA的MS固体培养基上,已获得部分拟转基因植株,对18株拟转基因植株进行PCR检测,结果表明GUS阳性植株为16株,占88.9%。其他抗性愈伤组织的植株再生研究正在进行中。

全文目录

1 绪论  11-26
  1.1 引言  11-12
  1.2 转基因作物种植现状  12-14
    1.2.1 转基因作物种植面积的发展  12-13
    1.2.2 2003年转基因作物种植情况  13-14
    1.2.3 转基因作物种植中存在的问题  14
  1.3 植物遗传转化的影响因素  14-20
    1.3.1 AgNO_3在植物组织培养中的应用  14-18
    1.3.2 乙酰丁香酮(AS)在植物遗传转化中的应用  18-19
    1.3.3 甘露醇在植物遗传转化中的应用  19-20
  1.4 甘薯遗传转化研究进展  20-24
    1.4.1 转化受体材料  21
    1.4.2 主要转化方法  21-23
    1.4.3 转化条件的研究  23
    1.4.4 有益农艺性状基因的应用  23-24
  1.5 甘薯遗传转化中存在的问题  24-25
  1.6 本研究的目的与意义  25-26
2 材料与方法  26-35
  2.1 植物材料  26
    2.1.1 胚性愈伤组织的诱导  26
    2.1.2 胚性细胞悬浮培养  26
  2.2 根癌农杆菌菌株和质粒  26-27
    2.2.1 根癌农杆菌菌株、质粒及其携带的基因  26-27
    2.2.2 根癌农杆菌菌株的保存  27
    2.2.3 根癌农杆菌菌株的活化和菌液的制备  27
  2.3 实验仪器、设备  27
  2.4 各种培养基、试剂的配制  27-29
  2.5 转化效率影响因素的确定及试验设计  29-30
    2.5.1 转化效率影响因素的确定  29-30
    2.5.2 试验设计  30
  2.6 侵染和共培养  30-31
  2.7 适宜选择压的确定  31-32
  2.8 选择培养和植株再生  32
  2.9 GUS检测  32
  2.10 转基因植株的PCR检测  32-35
    2.10.1 植物总DNA的提取  32-33
    2.10.2 转基因植株的PCR检测  33-35
3 结果与分析  35-44
  3.1 胚性愈伤组织的诱导  35
  3.2 胚性细胞悬浮培养系的建立  35
  3.3 适宜选择压的确定  35-37
  3.4 根癌农杆菌浓度(OD_(600NM))对转化效率的影响  37
  3.5 共培养时间对转化效率的影响  37-38
  3.6 胚性悬浮细胞继代培养时间、高渗处理、AGNO_3浓度和AS浓度对转化效率的影响  38-39
  3.7 KAN抗性愈伤组织的形成及组织化学检测  39-41
  3.8 转基因植株再生  41-43
  3.9 转基因植株的PCR检测  43-44
4 讨论  44-51
  4.1 基因型对甘薯遗传转化的影响  44
  4.2 外植体种类对甘薯遗传转化的影响  44-45
  4.3 转化方法对甘薯遗传转化的影响  45
  4.4 根癌农杆菌菌液浓度对甘薯遗传转化的影响  45
  4.5 侵染后静置暗培养时间对甘薯遗传转化的影响  45-46
  4.6 甘露醇高渗处理对甘薯遗传转化的影响  46
  4.7 共培养时AGNO_3对甘薯遗传转化的影响  46-47
  4.8 AS对甘薯遗传转化的影响  47
  4.9 选择压对甘薯遗传转化的影响  47-48
  4.10 新型选择标记体系对提高甘薯遗传转化效率的展望  48-51
5 结论  51-52
参考文献  52-61
致谢  61-62
个人简介  62

甘薯品种徐薯18遗传转化体系的研究

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