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适于甘薯的米根霉L-乳酸高产菌株的选育及发酵条件优化

作　者: 陈晓丹
导　师: 王关林
学　校: 辽宁师范大学
专　业: 植物学
关键词: 米根霉甘薯 L-乳酸诱变育种发酵条件优化
分类号: Q93
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

乳酸是工业领域中广泛应用的一种重要有机酸,L-乳酸及其衍生物在食品、医药、化工等领域中有着广泛的应用,高光学纯度L-乳酸具有较高的商业价值,其前景非常广阔。微生物发酵法可获得纯L-乳酸,其原料为小麦、玉米、甘薯之类的可再生的生物资源,成本较低,因此微生物发酵法生产L-乳酸有着重要意义。目前国内外发酵法生产L-乳酸的原料多为玉米和大米,甘薯作为原料发酵生产L-乳酸的研究较少,主要是由于甘薯淀粉多为支链淀粉,发酵的米根霉菌株转化率较低。但是甘薯与玉米、大米相比较,具有作物产量高,淀粉等糖类物质含量高以及抗逆境等优点。米根霉（Rhizopus Oryzae）是发酵生产高光学纯度的L-乳酸的主要菌株,其发酵产L-乳酸具有营养要求简单、产品光学纯度高等优点,但是也存在产量不高、副产物含量多等不足,因此其优良菌株的诱变选育具有一定的现实意义。本实验以米根霉（Rhizopus Oryzae）3.1179作为出发菌株,经紫外线、⁶⁰Coγ射线和NTG单因素诱变处理,分别获得其单因素的最佳诱变时间及剂量,并进行复合诱变研究。结果表明,复合诱变具有一定的高效性。出发菌株经单因素和复合诱变的不同处理后,观察到复合诱变的致死率和正突变率都较单因素诱变有提高。经试验选出米根霉3.1179的最佳诱变方案为⁶⁰Coγ500Gy+UV80s+NTG0.15mg/ml。根据此诱变方案对出发菌株进行诱变筛选,经过平板初筛和发酵复筛,选育出六株高产突变菌株,其中突变菌株A-6产酸能力最强,其利用甘薯生粉发酵的能力较强,遗传性状较稳定。研究中发现,突变菌株A-6与出发菌株米根霉3.1179相比,利用甘薯生粉发酵生产乳酸的能力有明显提高。淀粉酶活性与乳酸脱氢酶活性的研究结果表明该突变菌株乳酸脱氢酶和淀粉酶活性增强。通过对突变菌株米根霉A-6发酵工艺条件的优化得出:其最佳种子培养基装液量60mL/150mL,种子培养时间20h;发酵培养基为:甘薯生粉120g/L,（NH₄）Cl 4g/L,KH₂PO₄0.4g/L,MgSO₄·7H₂O 0.25g/L,ZnSO₄·7H₂O 0.05g/L:发酵条件为:发酵培养基装液量75mL/150mL,接种量7.5%,CaCO₃添加时间6～12h,培养温度30℃,摇床转速180r/min。在优化工艺条件下进行发酵,突变菌株米根霉A-6的乳酸产量为52.8g/L,对总糖的利用率达64.7%分别比出发菌株高出了48.6%和63.8%。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-9
第一章前言  9-21
  1.1 乳酸简介  9-11
    1.1.1 乳酸的结构与性质  9-10
    1.1.2 L-乳酸的应用  10-11
  1.2 乳酸的生产方法  11-14
    1.2.1 化学合成法  11
    1.2.2 酶法  11-12
    1.2.3 微生物发酵法  12-14
    1.2.4 乳酸生产方法的比较  14
  1.3 米根霉生产 L-乳酸的发酵工艺进展  14-16
    1.3.1 微生物固定化技术  14-15
    1.3.2 乳酸原位分离技术  15-16
  1.4 米根霉发酵生产 L-乳酸的碳源  16-17
    1.4.1 甘薯淀粉概述  16-17
    1.4.2 淀粉酶  17
    1.4.3 甘薯的开发现状  17
  1.5 诱变育种  17-20
    1.5.1 诱变剂及其原理  17-19
    1.5.2 微生物空间诱变育种  19-20
    1.5.3 米根霉高产乳酸菌种选育的研究进展  20
  1.6 本研究的目的及意义  20-21
第二章 L-乳酸高产菌株诱变技术的研究  21-27
  2.1 前言  21
  2.2 材料与试剂  21
    2.2.1 材料  21
    2.2.2 主要试剂  21
  2.3 仪器与设备  21
  2.4 培养基  21
    2.4.1 斜面培养基  21
    2.4.2 固体筛选培养基  21
    2.4.3 培养基的灭菌方法  21
    2.4.4 培养方法  21
  2.5 实验方法  21-22
    2.5.1 出发菌株的活化  21-22
    2.5.2 孢子悬液的制备  22
    2.5.3 诱变方法  22
  2.6 分析方法  22
    2.6.1 计数方法  22
  2.7 菌种选育方案设计  22-23
    2.7.1 筛选方法  22-23
    2.7.2 最佳诱变方案设计  23
  2.8 结果与分析  23-26
    2.8.1 紫外诱变结果  23-24
    2.8.2 ~(60)Coγ辐射诱变结果  24-25
    2.8.3 NTG诱变结果  25
    2.8.4 确定最佳诱变剂量  25-26
    2.8.5 复合诱变结果  26
  2.9 小结  26-27
第三章 L-乳酸高产菌株的选育  27-33
  3.1 材料与试剂  27
    3.1.1 材料  27
    3.1.2 主要试剂  27
  3.2 仪器与设备  27
  3.3 培养基  27
    3.3.1 斜面培养基  27
    3.3.2 固体筛选培养基  27
    3.3.3 种子和发酵培养基  27
  3.4 育种方案  27
  3.5 筛选方法  27-28
    3.5.1 初筛方法  28
    3.5.2 复筛方法  28
  3.6 实验方法  28-29
    3.6.1 菌株的诱变及初筛  28
    3.6.2 发酵复筛  28
    3.6.3 出发菌株发酵特性研究  28-29
    3.6.4 突变菌株发酵特性的研究  29
    3.6.5 出发菌与突变菌的酶活测定  29
    3.6.6 突变菌的遗传稳定性实验  29
  3.7 分析方法  29
    3.7.1 计数方法  29
    3.7.2 L-乳酸的测定  29
    3.7.3 残糖的测定  29
    3.7.4 生物量的测定  29
    3.7.5 LDH活性测定  29
    3.7.6 淀粉酶活测定  29
  3.8 结果与分析  29-32
    3.8.1 葡萄糖标准曲线  29-30
    3.8.2 最优突变菌株的选育  30
    3.8.3 出发菌株发酵特性研究  30-31
    3.8.4 突变菌株发酵特性研究  31-32
    3.8.5 酶活性的比较  32
    3.8.6 突变菌株的遗传稳定性实验  32
  3.9 小结  32-33
第四章突变菌株发酵条件的优化  33-44
  4.1 材料与试剂  33
    4.1.1 材料  33
    4.1.2 主要试剂  33
  4.2 仪器与设备  33
  4.3 培养基  33
    4.3.1 斜面培养基  33
    4.3.3 种子和发酵培养基  33
  4.4 实验方法  33-34
    4.4.1 米根霉的发酵  33
    4.4.2 孢子计数  33-34
    4.4.3 乳酸的定量  34
    4.4.4 乳酸的定性  34
    4.4.5 pH值测定  34
    4.4.6 菌丝的湿重  34
  4.5 结果与讨论  34-43
    4.5.1 孢子的选择与制备  34
    4.5.2 液体种子培养的优化  34-36
    4.5.3 发酵培养基的优化  36-39
    4.5.4 发酵条件的优化  39-43
    4.5.6 出发菌株和突变菌株最佳工艺条件的比较  43
    4.5.7 优化工艺条件下的发酵试验  43
  4.6 小结  43-44
第五章结论与展望  44-45
  5.1 结论  44
  5.2 展望  44-45
参考文献  45-48
致谢  48-49

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