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腐烂茎线虫不同群体同工酶表型与生物学特性研究

作　者: 王宏宝
导　师: 林茂松
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 腐烂茎线虫甘薯同工酶生物学特性杂交 ITS-PCR-RFLP 耐寒力
分类号: S435.31
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

甘薯茎线虫病是我国甘薯生产上重要病害之一,该病病原腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为我国检疫性病害。腐烂茎线虫最早在马铃薯上发现,该线虫除了危害甘薯外,还危害花生、茄子、薄荷、甜菜和草莓等作物。本实验以来自国内的10个腐烂茎线虫群体为研究材料,做了以下几方面的研究：对国内不同地理来源的10个腐烂茎线虫群体进行同工酶表型研究。结果表明：1)在对DeJL和DeLJ 2个群体的同工酶梯度分析中发现,碾样200、400、600条线虫的10μl提取液中,只有碾样400条线虫提取液对DeJL和DeLJ表型研究均有较好的染色效果；2)10个群体苹果酸脱氢酶(MDH)酶谱分为2个酶型,酶型Ⅰ的相对迁移率(Rf值)约为0.21、0.26；酶型Ⅱ的Rf值约为0.21、0.26、0.31,而酯酶染色不成形；3)结合MDH表型和核糖体ITS区核酸序列分析,将腐烂茎线虫划分为3个不同遗传类型。对国内不同地理来源的10个腐烂茎线虫群体在两个中抗甘薯茎线虫病品种(苏薯9号、宁薯9-9)上测定腐烂茎线虫群体致病力、繁殖力、雌雄比(性比)、甘薯薯块鲜重损失量。结果表明：1)在P=0.05水平上,各群体间的致病力、繁殖力、性比差异显著,其中致病力最高的群体来自河北廊坊DeHB,对苏薯9号的致病力为75%(即苏薯的病情指数为75%)；2)在苏薯9号和宁薯9-9上,各线虫群体致病力与线虫繁殖力呈正相关；3)偏相关分析显示,在苏薯9号上不同线虫群体繁殖力与性比呈负相关,相关系数低,只为-0.213,而在宁薯9-9上不同群体繁殖力与性比呈显著正相关,相关系数高,为0.901,说明寄主品种的改变对线虫群体性别分化影响显著；4)在抗甘薯茎线虫病和保鲜力方面,宁薯9-9分别比苏薯9号高33.48%和19.86%。将腐烂茎线虫2个基因型进行杂交,在48个正反交组合中,33个杂交组合未产生后代,15个组合产生的F1代死亡,2个组合"DeLYxDeYL"和"DeSDxDeHB"产生活力很弱的F1代幼虫,继代培养未能产生可延续的后代；所有的杂交组合中所产生的F1代均为幼虫且其数量在P0.05水平上均显著低于亲本对照组；对"DeLYxDeYL"和"DeSDxDeHB"2个组合的F1代进行ITS-PCR扩增产物和RsaⅠ、HaeⅢ、HinfⅠ3种内切酶的酶切(RFLP)分析显示,F1代ITS区PCR产物与其母本条带长度较一致,约为800bp,2个杂交代与其亲本的酶切图谱在3个酶切位点上差异显著；对同一基因型内的线虫种群间杂交发现,杂交均能成功且产生可育的后代,对其F1代同样进行ITS区扩增产物和RFLP分析,发现同一基因型内杂交后代ITS区扩增产物和RFLP图谱与其亲本一致。说明我国甘薯腐烂茎线虫种群间分化现象严重,变异复杂,即基因型A4个种群分别与基因型B 6个种群间杂交不亲和,存在生殖隔离现象,我国甘薯腐烂茎线虫很可能是一个包含两种不同线虫的复合种。对5个不同地理来源的腐烂茎线虫群体分别接种到甘薯(待其发病腐烂时做以下实验处理)、甘油和细沙3种介质中,在-20℃和-70℃温度下经过不同的处理时间测定其存活率来研究腐烂茎线虫耐寒力,并探索腐烂茎线虫在低温冷冻下的保存方法。腐烂茎线虫在-20℃和-70℃低温下,随着处理时间的延长,不同群体线虫的存活率都有所下降,其中DeWY和DeLJ群体在不同处理时间下的存活率均高于其它3个群体,且在P0.01水平下均达到极显著差异,初步证实这2个群体有很强的耐寒力。试验发现在细沙和不同甘油浓度条件下,所有线虫群体在低温处理下均未查到活虫。腐烂茎线虫在低温下的生存状态依赖于原寄主材料,甘薯薯块是腐烂茎线虫在低温下抵御逆境最好的屏障,腐烂茎线虫侵染的薯块放在低温下保存,在遗传学研究等方面保存原始线虫种源有应用价值。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
前言  11-12
上篇文献综述  12-31
  第一章腐烂茎线虫的发生、分布及危害  13-18
    1 分类地位  13
    2 形态描述  13-14
    3 生物学特性  14-15
    4 地理分布  15
    5 寄主范围与致病性  15-16
    6 危害症状及经济重要性  16
    7 致病机理与综合防治  16-18
  第二章植物线虫的分类鉴定方法与分类现状  18-27
    1 形态学分类鉴定  18-19
      1.1 光学显微镜技术  18
      1.2 电子显微镜技术  18-19
    2 鉴别寄主反应  19
    3 生物化学和分子生物学鉴定  19-24
      3.1 同工酶鉴定  20
      3.2 分子生物学鉴定  20-24
    4 特异引物的应用  24-25
    5 植物线虫分类的现状评述  25-27
  第三章我国国内腐烂茎线虫研究现状  27-31
    1 腐烂茎线虫所表现的特殊变异性  27-28
    2 关于腐烂茎线虫两类基因型的相关报道  28-29
    3 对线虫分子系统学研究中ITS区的认识  29
    4 研究目的与意义  29-31
下篇研究内容  31-60
  第一章腐烂茎线虫不同群体同工酶表型研究  32-37
    1 材料与方法  33-34
      1.1 腐烂茎线虫群体纯化培养  33
      1.2 同工酶分析及Rf值的计算方法  33-34
    2 结果与分析  34-35
      2.1 腐烂茎线虫同工酶梯度分析  34
      2.2 腐烂茎线虫不同群体同工酶分析  34-35
    3 结论与讨论  35-37
  第二章腐烂茎线虫不同群体生物学特性研究  37-44
    1 材料与方法  38-39
      1.1 腐烂茎线虫群体纯化培养  38
      1.2 致病性测定与不同致病群体的划分  38-39
      1.3 线虫繁殖力、性比和甘薯鲜重损失量的计算  39
      1.4 结果统计与数据处理  39
    2 结果与分析  39-43
      2.1 腐烂茎线虫不同群体致病力、繁殖力、雌雄比(性比)生物学指标及甘薯鲜重损失量的测定  39-40
      2.2 腐烂茎线虫生物学指标值相关性分析  40-41
      2.3 宁薯9-9的抗性效果  41-42
      2.4 腐烂茎线虫不同致病群体的划分  42-43
    3 结论与讨论  43-44
      3.1 腐烂茎线虫群体致病性比较与致病力分化  43
      3.2 腐烂茎线虫遗传背景与致病性的关系  43-44
  第三章腐烂茎线虫生物学杂交研究  44-54
    1 材料与方法  45-47
      1.1 线虫种群  45
      1.2 幼虫及雄虫的准备  45-46
      1.3 生物学杂交实验  46
      1.4 线虫DNA的提取  46-47
      1.5 ITS区域的PCR扩增  47
      1.6 杂交后代RFLP酶切  47
      1.7 结果统计与数据处理  47
    2 结果与分析  47-52
      2.1 腐烂茎线虫基因型间杂交结果  47-50
      2.2 甘薯腐烂茎线虫基因型内杂交结果  50-51
      2.3 杂交后代的ITS-PCR-RFLP分析  51
      2.4 杂交后代ITS区限制性酶切  51-52
    3 结论与讨论  52-54
  第四章腐烂茎线虫耐寒力测定  54-60
    1 材料与方法  55-56
      1.1 腐烂茎线虫群体纯化培养  55
      1.2 冷冻处理方法  55-56
      1.3 冷冻线虫的活力观察与计数  56
      1.4 数据处理  56
    2 结果与分析  56-57
      2.1 腐烂茎线虫在-20℃和-70℃的存活率  56-57
    3 结论与讨论  57-60
全文结论  60-62
参考文献  62-70
致谢  70

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