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淋球菌nspA基因原核重组质粒的构建及表达

作　者: 吴敏芳
导　师: 张雷
学　校: 大理学院
专　业: 病原生物学
关键词: 淋球菌免疫血清 nspA 克隆原核表达
分类号: R346
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

研究目的制备淋球菌免疫血清,用于Western Blot技术中以检测NspA重组蛋白的表达情况；构建淋球菌奈瑟氏表面蛋白A(Neisseria surface protein A, NspA)基因原核表达载体,并诱导NspA融合蛋白在宿主菌BL21 (DE3)中表达,为淋球菌NspA蛋白的进一步研究提供基础。研究方法淋球菌免疫血清的制备：制备灭活淋球菌菌体、淋球菌裂解物两种免疫原,免疫家兔后收获免疫血清。用于Western Blot技术中以检测NspA重组蛋白的表达情况。构建pGEX4T-1-nspA原核表达载体并诱导表达：根据基因库报道的淋球菌nspA基因序列,设计合成一对引物；以淋球菌基因组DNA为模板,PCR扩增淋球菌nspA基因；将PCR扩增产物与带有谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-tramsferases GSTs)基因的高效原核表达质粒pGEX4T-1定向重组,构建原核表达重组体pGEX4T-1-nspA;重组子经酶切、PCR鉴定和核酸序列分析正确后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白表达,用SDS-PAGE及Western blot技术检测重组蛋白表达情况。结果成功制备淋球菌免疫血清：制备的两组免疫血清效价均达到1：12800以上,并将其用于Western Blot检测重组蛋白的表达,在约44KDa位置出现特异性结合条带；成功构建pGEX4T-1-nspA原核表达载体并诱导表达以淋球菌基因组DNA为模板,通过PCR扩增,获得淋球菌nspA基因；经双酶切、PCR和核酸序列分析表明：成功构建淋球菌nspA基因原核表达重组体pGEX4T-1-nspA; SDS-PAGE及Western blot分析显示：重组nspA基因在原核系统中得到了表达,融合蛋白大小约44kDa。结论成功制备兔抗淋球菌免疫血清,并能特异性识别NspA重组蛋白并与之结合,为本研究及后续的淋球菌其他研究提供准备；成功构建pGEX4T-1-nspA原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为研究NspA蛋白的生物活性、淋球菌动物免疫实验、淋球菌检测及其作为粘膜免疫疫苗的研究等应用价值奠定基础。

全文目录

中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-13
实验材料  13-20
  1 主要耗材  13
  2 主要实验试剂  13-14
  3 主要仪器  14-15
  4 主要试剂配制  15-19
  5 菌株  19
  6 实验动物  19-20
技术路线  20-21
第一部分淋球菌免疫血清的制备  21-29
  1 引言  21
  2 方法  21-25
    2.1 免疫原制备  21-22
    2.2 免疫方案  22-23
    2.3 收集免疫血清  23-25
    2.4 抗体效价测定  25
  3 结果  25-27
  4 讨论  27-28
  5 小结  28-29
第二部分淋球菌nspA基因原核重组质粒的构建及表达  29-46
  1 引言  29
  2 方法  29-36
    2.1 pGEX4T-1-nspA原核表达载体的构建与鉴定  29-33
    2.2 IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌中表达  33
    2.3 重组质粒表达产物的检测  33-36
  3 结果  36-44
  4 讨论  44-45
  5 小结  45-46
全文总结  46-47
参考文献  47-50
附录  50-51
综述  51-60
  参考文献  57-60
致谢  60

淋球菌nspA基因原核重组质粒的构建及表达

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