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传染性法氏囊病病毒结构蛋白VP2基因真核表达质粒的构建、表达及其DNA疫苗对鸡体的免疫保护

作　者: 王小泉
导　师: 姜平
学　校: 南京农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 传染性法氏囊病 病毒结构蛋白 VP2基因 真核表达 DNA疫苗 免疫保护 重组质粒DNA 免疫组 结构蛋白VP2 免疫增效剂
分类号: S852.65
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


自七十年代末国内首次分离传染性法氏囊病毒（IBDV）以来，国内学者在IBDV病毒形态结构和免疫学特性等方面作了大量研究。本室从90年代初也已开展分子生物学研究，1993年陈士友博士在国内首次构建成功IBDV cDNA文库，1997年姜平博士首次用Goldkey软件设计IBDV PCR引物，建立了RT-PCR法，获得了野毒株IBDV病毒主要结构蛋白VP2、VP3蛋白基因，并分别于原核表达载体中表达，研究其作为基因工程苗的可行性，为基因疫苗研究奠定了基础。1999年候继波博士构建了传染性法氏囊病毒A片段的cDNA文库并进行了全序列测定。 本研究在此基础上，从采自发病鸡场的法氏囊组织分离病毒，并进行琼脂扩散试验和鸡体回归试验，所得的病毒定名为IBDV 99J1株。首先参照标准株Cu-1序列，用Goldkey软件设计两对IBDV PCR引物，并在引物两个设计了酶切位点，通过反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增并克隆了IBDV99J1的VP2基因，为进一步构建真核表达载体奠定了基础。将IBDV VP2插入真核表达质粒pcDNA3.1（-）及pCl中，置于CMV启动子的调控之下，构建成DNA疫苗表达质粒VP2pcDNA、VP2pCl，分别转染COS-7细胞，转染24小时后每12小时取细胞裂解液报道基因检测，并进行间接免疫荧光试验和Dot-ELISA检测，筛选出阳性表达的质粒。 用IBDV VP2重组质粒DNA及用含CpG、作为免疫增效剂的核酸分点肌肉注射14日龄非免疫鸡，21日龄再免一次，二次免疫后14天和21天测定血清ELISA抗体效价。并于免疫后21天用IBDV 99J1株攻毒，结果显示：1 VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；2 VP2弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；3 VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及VP2弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率；4重组质粒免疫及相关免疫组ELISA抗体持续产生。 尽管还不能与常规疫苗一样有效，但是该试验结果鼓励我们进一步向DNA疫苗努力。尤其是这种DNA疫苗没有散毒的危险。

全文目录


中文摘要  5-6
英文摘要  6-8
引言  8-10
文献综述  10-21
  第一章 传染性法氏囊病毒基因工程疫苗研究进展  10-14
  第二章 核酸疫苗  14-21
研究内容  21-41
  第一章 传染性法氏囊病毒VP2基因真核表达重组质粒的构建与表达  21-35
    摘要  21-22
    一 材料与方法  22-27
      1 材料  22-23
        1．1 材料  22
        1．2 质粒、菌种及细胞  22
        1．3 试剂  22
        1．4 病毒的鉴定  22-23
          1．4．1 琼脂扩散试验  22-23
          1．4．2 动物回归试验  23
      2 方法  23-27
        2．1 引物设计  23
        2．2 传染性法氏囊病毒VP2基因的扩增  23-24
          2．2．1 病毒核酸的提取  23-24
          2．2．2 反转录  24
          2．2．3 聚合酶链反应  24
        2．3 传染性法氏囊病毒VP2基因的克隆与鉴定  24
          2．3．1 PCR产物的克隆与回收  24
          2．3．2 重组质粒的构建  24
            2．3．2．1 DNA常规操作  24
            2．3．2．2 VP2 PCR产物克隆入真核表达载体  24
        2．4 VP2真核表达质粒在COS-7细胞中的表达  24-26
          2．4．1 质粒的大量提取与纯化  24-25
            2．4．1．1 大量提取质粒  25
            2．4．1．2 聚乙二醇沉淀法纯化质粒DNA  25
          2．4．2 细胞转染  25-26
            2．4．2．1 转染细胞的准备  25
            2．4．2．2 FuGENE Transfection Reagent：DNA复合物的准备  25-26
            2．4．2．3 转染细胞  26
        2．5 VP2基因表达产物的鉴定  26-27
          2．5．1 报道基因试验  26
          2．5．2 免疫荧光试验  26
          2．5．3 Dot-ELISA  26-27
    二 结果与讨论  27-35
      2．1 动物回归实验结果  27
      2．2 99J1株IBDV VP2基因的RT-PCR扩增  27
      2．3 99J1株IBDV VP2基因的克隆与鉴定  27
      2．4 重组质粒的大量提取与纯化  27-28
      2．5 VP2基因表达产物的检测  28-35
        2．5．1 报道基因的检测  28
        2．5．2 间接荧光试验  28
        2．5．3 Dot-ELISA  28-35
  第二章 传染性法氏囊病毒VP2基因真核表达重组质粒的免疫学试验  35-41
    摘要  35
    一 材料与方法  35-37
      1 质粒与菌种  35
      2 VP2基因重组质粒的制备  35
      3 CpGODN  35
      4 试验动物分组及免疫  35-36
      5 IBDV ELISA抗原浓度及血清最佳稀释度的方阵测定  36
      6 ELISA抗体的检测  36
      7 攻毒保护试验  36-37
    二 结果  37-38
      1 IBDV ELISA抗原浓度及血清最佳稀释度的方阵测定结果  37
      2 ELISA检测结果  37-38
      3 攻毒实验结果  38
    三 讨论  38-41
参考文献  41-48
致谢  48

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医基础科学 > 家畜微生物学（兽医病原微生物学） > 家畜病毒学
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