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抗重金属汞、铜、锌单抗可变区序列的克隆鉴定、真核表达及三维模拟

作　者: 李鹏
导　师: 刘凤权
学　校: 南京农业大学
专　业: 植物病理学
关键词: 重金属单抗 序列分析 真核表达 蛋白间相互作用 三维模拟
分类号: X171.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


重金属类污染物具有明显的生物毒性,可在生物体内长期积累而不降解,微量残留也会严重威胁人类健康。重金属免疫学检测技术因具有快速、灵敏、简单的特性而得到青睐。多株特异性针对重金属的单抗及其检测体系都被开发出来。然而目前得到的抗体应用到实际检测中时仍有较大局限性,主要存在制备成本高,金属离子交叉反应性强,环境基质复杂影响灵敏性等问题。利用抗体基因工程对抗原抗体结合分子机制进行深入研究则为这些问题的解决奠定了基础。本研究旨在通过RT-PCR的方法克隆出三株本实验室开发的抗重金属汞、铜、锌单抗的可变区序列,构建入真核表达载体并获得具有活性的重组抗体,结合各抗体的空间三维模型得到抗原互补决定区的初步特征,为下一步抗体改造研究奠定基础。以本实验室筛选得到的IgM (κ)型重金属单抗细胞系3G4G5(抗Hg(Ⅱ)-ITCBE)、9D11(抗Cu(Ⅱ)-SCN-DTPA、2E8E3(抗Zn(Ⅱ)-SCN-DTPA)为材料,设计了从信号肽区到第一恒定区半胱氨酸(Cys)残基附近的引物,采用RT-PCR的方法克隆到各抗体可变区序列并通过BLAST、SingalP、IMGT/V-QUEST分析鉴定为正确的小鼠免疫球蛋白可变区,将所获得序列提交到NCBI并获得相应序列号。随后,以获得的可变区序列为基础,构建了其真核共表达载体,分别通过脂染法及磷酸钙法转染了293T细胞,优化了磷酸钙法转染体系并初步纯化得到重组抗体蛋白。优化后的转染体系为：pH在7.0-7.2范围内,以大于80%的细胞平铺率转染293T细胞系24h后得到最大量的蛋白表达。ELISA测定结果表明重组抗体活性约为天然抗体的20%。为探讨重组抗体重、轻链分别表达后能否相互结合,构建了双分子荧光互补报告质粒pBudCE4.1-VHCEYFP-VLNEYFP。它利用分别融合于诱导蛋白和靶蛋白上的分离荧光蛋白片段可以在诱导蛋白与靶蛋白相互作用的驱动力下重新结合而发出荧光的特性来研究蛋白-蛋白相互作用。转染实验结果表明VH与VL可以自发结合,结合ELISA测定的蛋白活性结果证明克隆策略是可行的。由克隆到的各抗体氨基酸可变区序列,利用Swiss-Model服务器及其他辅助软件同源模建了三个抗体的三维空间结构模型,结合抗In-EDTA抗体CHA255的晶体学结构及蛋白分子中与金属螯合物具有可能结合活性的氨基酸残基性质,推测了其抗原互补决定区中可能的关键氨基酸残基。以上研究取得的实验结果,不但可以顺利开展高亲和力基因工程抗体的筛选,开发用于农产品安全检测的重金属快速检测试剂盒,也为抗原抗体结合分子机制的理论研究提供了良好平台。

全文目录


摘要  6-8ABSTRACT  8-10上篇 文献综述  10-24  第一章 文献综述  11-24    1 汞、铜、锌的污染及其残留检测技术  12-13      1.1 汞污染及其危害  12      1.2 铜污染及其危害  12      1.3 锌污染及其危害  12-13      1.4 重金属的残留检测技术  13    2 基因工程抗体  13-17      2.1 基因工程抗体简介  13-14      2.2 基因工程抗体的表达  14-16      2.3 利用双分子荧光互补技术研究V_H与V_L的相互作用  16      2.4 基因工程抗体在重金属残留检测中的应用  16-17    3 重组抗体的三维建模及重要氨基酸残基的鉴别  17-20      3.1 重组抗体的三维建模  17-19      3.2 抗体CDR区中关键氨基酸残基的鉴别  19-20    4 本研究的目的及意义  20    参考文献  20-24下篇 研究内容  24-85  第二章 抗重金属汞、铜、锌单抗可变区的克隆及鉴定  25-47    1 引言  26-27    2 材料与方法  27-35      2.1 实验材料  27-28      2.2 实验方法  28-35    3 结果与分析  35-42      3.1 总RNA的提取  35      3.2 内参基因扩增反转录的第一链cDNA  35-36      3.3 通过RT-PCR扩增各单抗的V_H、V_L  36-37      3.4 各可变区序列克隆入pGM-T载体并测序  37-38      3.5 测序序列的鉴定及分析  38-42    4 讨论  42-43    5 结论  43    参考文献  43-47  第三章 抗重金属汞、铜、锌单抗可变区序列的真核表达及初步鉴定  47-63    1 引言  48    2 材料与方法  48-55      2.1 实验材料  48-49      2.2 实验方法  49-55    3 结果与分析  55-59      3.1 表达载体pBudCE4.1-3G4G5、pBudCE4.1-9D11、pBudCE4.1-2E8E3的构建  55-56      3.2 报告载体pBudCE4.1-CMV-EGFP的构建  56      3.3 报告载体pBudCE4.1-EF-EGFP的构建  56      3.4 真核细胞转染体系的优化  56-59      3.5 间接ELISA法测定表达产物的活性  59    4 讨论  59-60    5 结论  60    参考文献  60-63  第四章 重组表达抗体VH与VL相互作用的探讨  63-73    1 引言  63-65    2 材料与方法  65-68      2.1 材料  65      2.2 方法  65-68    3 结果与分析  68-70      3.1 通过PCR扩增各片段  68-69      3.2 双酶切及测序鉴定构建的pBudCE4.1-V_HCEYFP-V_LNEYFP质粒  69      3.3 荧光表达结果  69-70    4 讨论  70    5 结论  70    参考文献  70-73  第五章 抗重金属汞、铜、锌单抗重组抗体的三维结构模拟  73-85    1 引言  74    2 材料与方法  74-75      2.1 实验材料  74      2.2 实验方法  74-75    3 结果与分析  75-82      3.1 汞抗体3G4G5的三维模拟  75-77      3.2 铜抗体9D11的三维模拟  77-79      3.3 锌抗体2E8E3的模拟  79-81      3.4 抗原互补决定区与关键氨基酸残基的预测  81-82    4 讨论  82-83    5 结论  83    参考文献  83-85第六章 全文总结、创新点及后续展望  85-87  1 全文总结  85  2 创新点  85-86  3 存在的问题  86  4 研究展望  86-87攻读硕士期间发表的学术论文  87-89致谢  89

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境科学基础理论 > 环境生物学 > 生态系统与污染生态学 > 污染生态学
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