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雄原核注射sMTPGH基因小鼠胚胎的体外培养

作　者: 孙燕
导　师: 张家骅
学　校: 西南农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: sMTPGH 显微注射 转基因 胚胎体外培养 2-细胞阻断 PCR
分类号: S814.8
类　型: 硕士论文
年　份: 2001年
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内容摘要


转基因动物的建立是一项复杂而艰苦的工作，提高转基因动物的生产效率一直是多年来转基因研究的重点之一。将转基因胚胎在体外培养至可供移植的桑格或囊胚阶段，并在移植入受体之前对其进行检测无疑可以极大地提高转基因动物的生产效率，对转基因动物建立具有重要意义。鉴于此，实验采用显微注射法生产小鼠转基因胚胎，并采用体外培养体系将其培养至囊胚，然后对囊胚期胚胎外源基因整合情况进行了研究，以期为进一步探索转基因胚胎植入受体前的体外培养和在大动物进行转基因的检测提供依据。 实验采用质粒sMTPGH转化感受态细胞，大量提取转化菌落细菌DNA，经Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切鉴定后，纯化经Hind Ⅲ酶切的线状DNA片段用于显微注射，导入受精卵雄原核。由58只超数排卵处理的小鼠获得卵母细胞1697枚，从中选取可用于显微注射的原核期受精卵1278枚。使用纯化的羊金属硫蛋白（sMT）控制下的猪生长激素（PGH）基因为显微注射片段，在显微操作仪下用自制的显微工具针将其导入受精卵原核，经体外37℃、5％CO2、饱和湿度条件下短暂培养后，存活的胚胎率为30.67％。实验还比较了几种不同培养液对克服小鼠胚胎2-细胞发育阻滞及卵裂率、囊胚率的效果。采用改进的M16培养液（用mM16表示）能有效克服2-细胞阻滞现象，并使体外培养的转外源基因1-细胞小鼠胚胎发育到桑椹胚或囊胚阶段。在mM16培养液的基础上，再加入表皮生长因子（EGF），可使1-细胞胚胎发育到囊胚的比率进一步提高。在三种培养液（M16、mM16、mM16+EGF）中转外源基因胚胎越过2-细胞阻断期的比率分别为12％、68％、90％，发育到囊胚的百分率分别是0、20％和43％。 实验采用PCR方法检测了57枚经体外培养发育至囊胚的转基因胚，有4枚检测扩增出阳性条带，外源基因在囊胚期胚胎的整合率为7％。尽管PCR技术可能带来假阳性结果，需进一步的实验以验证4枚PCR阳性胚中外源基因是以游离片段的形式存在，或是整合到了胚胎基因组中。但如果能在囊胚期筛选出转基因阳性胚，则可能有目的地进行移植，避免盲目性。

全文目录


中文摘要  4-5
英文摘要  5-6
1． 文献综述  6-24
  1．1 外源基因导入技术  7-12
    1．1．1 显微注射法  7-9
    1．1．2 病毒介导的基因转移  9
    1．1．3 精子介导法  9-10
    1．1．4 胚胎干细胞法  10-12
  1．2 生产转基因家畜的技术路线  12-14
    1．2．1 经典的技术路线  12-13
    1．2．2 整合胚胎移植技术路线  13
    1．2．3 核移植（克隆）的技术路线  13-14
    1．2．4 整合卵技术路线  14
  1．3 转基因的整合与表达  14-21
    1．3．1 转基因的整合  15
    1．3．2 MAR与转基因整合表达  15-16
    1．3．3 内含子对表达的影响  16-17
    1．3．4 外源基因的错误剪接影响转基因的表达  17-18
    1．3．5 转基因表达的“援救”  18-19
    1．3．6 酵母人工染色体DNA  19
    1．3．7 乳蛋白基因转录调控的研究  19-21
  1．4 转基因动物的应用  21-24
    1．4．1 基础理论的研究（基因表达与调控研究）  21-22
    1．4．2 人类遗传病的转基因动物模型建立  22
    1．4．3 动物“生物反应器”  22-23
    1．4．4 用转基因动物生产人类器官替代品  23-24
2． 前言  24-26
3． 材料与方法  26-32
  3．1 材料  26-29
    3．1．1 DNA操作所用材料和仪器  26-27
    3．1．2 动物和胚胎操作所用材料和仪器  27-29
  3．2 方法  29-32
    3．2．1 DNA操作技术  29
    3．2．2 转基因实验方法  29-32
4． 结果与讨论  32-43
  4．1 结果  32-37
    4．1．1 重组质粒的滞后现象  32-33
    4．1．2 重组质粒的酶切鉴定  33
    4．1．3 原核时期的把握  33
    4．1．4 外源基因导入受精卵原核  33-34
    4．1．5 胚胎体外培养发育情况  34-36
    4．1．6 单个胚胎中外源基因的PCR检测  36-37
  4．2 讨论  37-43
    4．2．1 显微注射导入外源基因对原核胚的影响  37-38
    4．2．2 原核胚体外发育培养系统  38-41
    4．2．3 PCR对早期胚胎中外源基因的检测  41-43
5． 结论  43-44
致 谢  44-45
参考文献  45-49

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 普通畜牧学 > 畜禽繁殖 > 繁殖生物技术
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