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降低胞内转化提高重组毕赤酵母S-腺苷甲硫氨酸积累的代谢工程探索

作 者: 赵欣欣
导 师: 王永红;钱江潮
学 校: 华东理工大学
专 业: 微生物学
关键词: S-腺苷甲硫氨酸 毕赤酵母 基因敲除 S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因 S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因 L-甲硫氨酰tRNA合酶基因
分类号: TQ922
类 型: 硕士论文
年 份: 2011年
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内容摘要


S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)是一种重要的代谢中间物,已被用于多种临床症状的治疗及保健品。为了获得高产SAM的重组毕赤酵母,本研究以强化了SAM合成酶的高产菌株GS115/DS16为出发菌株,探索了敲除SAM代谢途径中3个基因对重组菌株中SAM积累的影响。通过同源重组方法,分别敲除SAM代谢途径中的S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶基因spe2、S-腺苷同型半胱氨酸水解酶基因sahl和L-甲硫氨酰tRNA合酶基因msml,构建了相应的重组菌GS115/Dspe、GS115/Dmsm和GS115/Dsah,并分别对三种基因敲除菌株的生长与SAM合成进行了考察。在摇瓶发酵水平,三种基因敲除菌株的生长与出发菌株相比没有明显变化,出发菌株GS115/DS16的产量为0.11g/gDCW,3种重组菌的SAM产量均有一定提高,GS115/Dspe菌株的产量提高到0.12g/gDCW, GS115/Dsah菌株的产量为0.13g/gDCW, GS115/Dmsm菌株产量为0.12g/gDCW。基因敲除可能抑制菌株了SAM在胞内转化利用,也提高了甲硫氨酸作为SAM合成底物的利用率,因此考察了外源添加底物甲硫氨酸补加量对3种不同基因敲除菌株合成SAM的影响。外源甲硫氨酸的补加量对GS115/Dspe菌株影响不大,GS115/Dsah菌株和GS115/Dmsm菌株更适合较低浓度的甲硫氨酸补加量。当甲硫氨酸补加量降至0.06%时,GS115/Dsah菌株可能由于转甲基和转巯基作用受到抑制,与甲硫氨酸补加量为0.1%时相比,SAM产量由0.13g/gDCW增加到0.15g/gDCW,提高了15.4%,与出发菌株GS115/DS16相比,优化后产量提高了36.4%。Dmsm菌株可能由于多胺的生成受到抑制,当甲硫氨酸补加量由0.1%降至0.06%时,SAM产量由0.12g/gDCW增加到0.13g/gDCW,提高了8.3%,与出发菌株GS115/DS16相比,优化后产量提高了18.2%。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
第1章 文献综述  9-19
  1.1 S-腺苷甲硫氨酸的生理和药用价值  9-10
    1.1.1 SAM的理化性质  9
    1.1.2 SAM在生物体内的代谢与生理作用  9-10
  1.2 促进SAM合成研究的现状  10-14
    1.2.1 SAM制备方法  10-11
    1.2.2 利用毕赤酵母合成SAM  11-14
  1.3 毕赤酵母SAM代谢途径及编码基因  14-17
  1.4 课题意义与内容  17-19
第2章 材料与方法  19-29
  2.1 材料部分  19-21
    2.1.1 菌种和质粒  19
    2.1.2 实验试剂  19-20
    2.1.3 实验仪器  20
    2.1.4 培养基  20-21
    2.1.5 溶液  21
  2.2 方法部分  21-29
    2.2.1 分子生物学方法  21-26
    2.2.2 检测方法  26-27
    2.2.3 重组菌的摇瓶培养  27-29
第3章 基因缺失重组毕赤酵母的构建  29-39
  3.1 前言  29
  3.2 中断质粒的构建  29-34
    3.2.1 用于构建中断质粒的同源片段的扩增  29-30
    3.2.2 质粒pDspe的构建和验证  30-31
    3.2.3 质粒pDspeZ的构建和验证  31-32
    3.2.4 质粒pDsahZ和pDmsmZ的构建和验证  32-34
  3.3 重组菌株GS115/Dsah、GS115/Dmsm、GS115/Dspe的构建及检验  34-37
  3.4 本章小结  37-39
第4章 基因敲除菌株生产SAM的表型研究  39-46
  4.1 基因敲除重组菌株的筛选  39-41
    4.1.1 重组菌株生长特性研究  39-41
    4.1.2 重组菌株细胞合成SAM产量研究  41
  4.2 L-Met添加量对重组菌GS115/Dsah细胞合成SAM的影响  41-42
  4.3 L-Met添加量对重组菌GS115/Dmsm合成SAM的影响  42-44
  4.4 本章小结  44-46
第5章 结论与展望  46-48
  5.1 结论  46-47
    5.1.1 获得了SAM代谢途径中3个基因分别中断的重组毕赤酵母  46
    5.1.2 不同重组毕赤酵母具有不同的表型  46
    5.1.3 不同的重组毕赤酵母发酵生产SAM的最优化条件不同  46-47
  5.2 展望  47-48
参考文献  48-51
致谢  51

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中图分类: > 工业技术 > 化学工业 > 其他化学工业 > 发酵工业 > 发酵法制氨基酸
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