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机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究

作　者: 刘洋
导　师: 李建福
学　校: 第三军医大学
专　业: 外科学
关键词: 皮肤软组织扩张术表皮干细胞短暂扩充细胞压应力增殖分化
分类号: R329
类　型: 硕士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

人体细胞生长在机体提供的微动力学环境中,机械应力不仅能引起细胞形态、结构变化,还能调控细胞的功能状态,影响细胞的增殖、分化及凋亡,在某些生理和病理过程中起着重要作用。业已证明,适当的机械应力可促进细胞增殖与分化,通过外力刺激因素获得“额外”组织的临床技术均是基于这一理论,并已在临床上收到了令人满意的疗效。如骨科的肢体牵引延长术、骨折的加压固定术、颅颌面外科的颅颌骨牵引术以及整形外科的皮肤软组织扩张术（skin soft-tissue expansion,SSTE）等。同时研究表明,不同种类的细胞有明显的异质性,对相同的应力刺激所表现出的效应不同,而同一细胞对不同的应力响应也不同,因此,其他研究领域的结果难于指导某一领域的临床实践。目前开展的相关基础研究比较活跃的领域主要集中在骨细胞（研究应力成骨）、血管平滑肌细胞（研究高血压）、血管内皮细胞、肾小球系膜细胞（研究肾小球性高血压）、以及肺上皮细胞等,而与SSTE相关的研究文献报道甚少。更未见应力与表皮干细胞（epidermal stem cells,ESCs）相关性的文献。自1976年Radovan发明可控式扩张器以来,SSTE已广泛应用于临床,数以万计的患者从中受益,现已成为整形外科的常规治疗手段之一。虽然SSTE经过了30年的发展,在实验研究、临床应用、扩张方法、并发症防治等诸多方面取得了长足的进展,然而,其扩张周期较长、并发症较多的缺憾仍尚未从更本上获得解决。因此,如何缩短扩张时间、减少并发症即成为SSTE研究领域的焦点问题。业已证明,扩张产生的“额外”皮肤来源于皮肤的机械蠕变、弹性扩张和生物性增殖,其中尽快获得生物性增殖、充分有效的刺激细胞的有丝分裂活动而获得所需要的“额外”皮肤量,可能是克服上述难题的根本所在,但迄今为止,皮肤细胞在扩张过程中的增殖分化行为尚不甚清楚。ESC作为皮肤组织的特异性干细胞,不仅是维持皮肤日常新陈代谢的主要功能细胞,而且与创面的修复亦紧密相关。但目前就有关ESC在SSTE过程中所起到的具体作用,或与皮肤扩张间的关系尚鲜为人知。为此,深入认识SSTE过程中ESC的分布、增殖与分化特征以及相关的调控机制,无疑对充实、完善SSTE基础理论以及对指导临床更加完美地应用SSTE有着极其重要的意义。为此,本研究拟以离体与在体两种手段开展以下实验观察:利用表皮干细胞及其增殖、分化过程中不同的细胞表面标志物以及增殖细胞核抗原（PCNA）标记增殖期细胞的特点,采用免疫组织化学法观察扩张过程中具有增殖能力的表皮干细胞、短暂扩充细胞的分布与数量差异,初步观察皮肤扩张术对表皮干细胞增殖分化的影响,可进一步研究表皮干细胞在皮肤扩张中的作用。此外,用机械应力作用于体外培养的细胞,研究其受应力作用后的各种变化,是目前细胞生物学领域发展十分迅速的一种方法。通过分离培养人表皮干细胞,建立可行的压应力细胞培养体系装置,观察和研究压应力对表皮干细胞增殖分化的影响。【目的】观察大鼠活体皮肤软组织扩张术对其扩张表皮细胞增殖分化特征的影响以及间歇压应力对离体表皮干细胞增殖分化特征的影响并探讨其可能的作用机制。【方法】1) 36只Wistar大鼠制作皮肤扩张动物模型,并随机分为扩张组和非扩张对照组。利用表皮干细胞表达角蛋白（keratin 19,K19）、p63,短暂扩充细胞表达K14及增殖细胞核抗原（PCNA）的特点,分别于扩张过程中与扩张后的不同时相点,采用链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法检测扩张皮肤表皮干细胞和短暂扩充细胞的分布特征,及常规HE染色观察扩张皮肤表皮的厚度改变。2)通过我们已建立的鼠表皮干细胞体外分离、培养的方法,进行人表皮干细胞的体外分离、培养,并利用链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法和细胞周期分析进行鉴定;采用培养细胞加压装置施以不同压应力（4kPa,6kPa,8kPa,10kPa,12kPa）对表皮干细胞加压,利用表皮干细胞特异性表达角蛋白19及终末分化细胞表达角蛋白10的特点,以链霉卵白素-生物素（SP）免疫组织化学染色法检测加压前后表皮干细胞和终末分化细胞的变化情况。【结果】1)扩张皮肤的表皮层明显增厚,不仅其基底层K19、p63、K14和PCNA阳性细胞的数量明显增多,而且在棘层和颗粒层可见K19、p63、K14及PCNA阳性细胞的表达;2)分离、培养的表皮干细胞K19免疫组化染色阳性,细胞周期分析有84.80%的细胞处于G₁期;8kPa以上的间歇压应力作用粘附于硅胶膜上的表皮干细胞1周后,其数量明显增多,免疫组化染色发现其中有角蛋白10阳性细胞。【结论】本研究发现皮肤软组织扩张术的应力能诱导大鼠表皮干细胞增殖与分化,皮肤扩张的过程既有应力诱导引起的增殖效应,又有应力造成的微损伤启动的创伤修复效应,是非典型的创面修复的病理生理过程,而在此过程中具有自我更新、无限增殖潜能和再生修复能力的表皮干细胞发挥着关键性的作用;同时也证实8kPa以上的间歇压应力能诱导表皮干细胞增殖分化,进一步提示表皮干细胞对机械应力的响应机制可能是皮肤软组织扩张术获得“额外皮肤”的主要的生物学基础。

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英文缩写一览表  4-5
ABSTRACT  5-7
中文摘要  7-10
正文机械应力对表皮干细胞增殖分化影响的研究  10-35
  前言  10-11
  第一部分皮肤软组织扩张术对大鼠表皮干细胞增殖、分化的影响  11-21
    材料和方法  11-15
    结果  15-18
    讨论  18-20
    参考文献  20-21
  第二部分压应力对体外培养的表皮干细胞增殖、分化的影响  21-32
    材料与方法  21-25
    结果  25-28
    讨论  28-31
    参考文献  31-32
  全文结论  32-34
  致谢  34-35
文献综述一表皮干细胞及其与创面修复研究进展  35-46
  参考文献  42-46
文献综述二细胞机械应力响应的生物学基础及机制研究进展  46-52
  参考文献  50-52
攻读硕士期间发表的文章  52

机械应力对表皮干细胞增殖、分化影响的研究

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