大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是我国养殖大菱鲆病毒性疾病的主要病原之一,TRBIV主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)是病毒最主要的结构蛋白。本研究运用酵母双杂交系统,筛选与TRBIV MCP相互作用的大" />

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大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白与宿主蛋白的相互作用研究

作　者: 王亚楠
导　师: 史成银；孔晓瑜
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水生生物
关键词: 大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白大菱鲆酵母双杂交蛋白相互作用
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

大菱鲆红体病虹彩病毒的学位论文">大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus,TRBIV)是我国养殖大菱鲆病毒性疾病的主要病原之一,TRBIV主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)是病毒最主要的结构蛋白。本研究运用酵母双杂交系统,筛选与TRBIV MCP相互作用的大菱鲆脾细胞蛋白,从而揭示虹彩病毒感染宿主细胞的分子机制,为鱼类虹彩病毒的致病机理研究打下基础。首先,构建了用于酵母双杂交的诱饵质粒pDEST32-MCP。采用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning kit构建了pENTR-MCP质粒;pENTR-MCP与载体pDEST32应用Gateway重组反应得到pDEST32-MCP质粒,经酶切鉴定确定重组子。利用CloneMiner. cDNA Library Construction Kit构建了大菱鲆(Scophthalmus maxims)脾细胞cDNA文库。从大菱鲆脾细胞中提取总RNA ,再分离纯化出mRNA。逆转录得到第一链cDNA,继而合成了双链平末端cDNA。经纯化定量后,应用GatewayBP技术同源重组,得到pDONR222-cDNA ,从而获得大菱鲆脾细胞cDNA文库。经测定扩增后文库滴度为2.52×107 cfu/ml,插入片段大部分分布在500-1000bp之间,平均大小约为787.6bp,可用作酵母双杂交的筛选文库。将pDEST32-MCP转入酵母菌株MaV203,通过自激活检测确定3AT浓度。pDONR222-cDNA通过Gateway LR重组反应与pDEST22载体连接,得到pDEST22-cDNA并转化入含有pDEST32-MCP的酵母菌株MaV203,分别在选择性平板上筛选阳性克隆,阳性克隆经序列测定p22大小为1117bp,p23大小为891bp, p31大小为491bp,p31与p23部分重合。分析结果表明,p23与60s核糖蛋白L23有很高的同源性,相似度达100%;p22无较大范围内的同源序列,说明是新的基因片段。另有4个表型为强阳性的克隆经鉴定不属于cDNA片段,其来源及序列结构有待进一步研究。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-11
第一章文献综述  11-22
  第一节鱼类抗病毒的非特异性免疫机制研究进展  11-18
    1. 自然杀伤细胞  11-13
    2. 单核巨噬细胞系统  13
    3. 干扰素  13-16
    4. 结语  16-18
  第二节酵母双杂交系统的原理及研究进展  18-22
    1. 酵母双杂交系统的构建原理  18-19
    2. 酵母双杂交系统的发展  19-22
第二章 pDEST32-MCP 诱饵质粒的构建  22-34
  1. 材料与方法  23-28
    1.1 TRBIV MCP 基因的PCR 扩增  23-25
    1.2 pENTR-MCP 重组质粒的构建与扩增  25-27
    1.3 pDEST32-MCP 诱饵重组质粒的构建与扩增  27-28
  2. 结果  28-32
    2.1 引物设计  28
    2.2 MCP 扩增结果  28-29
    2.3 PCR 产物的纯化与定量结果  29-30
    2.4 pENTR-MCP 的酶切鉴定  30
    2.5 pENTR-MCP 的测序结果  30
    2.6 pDEST32-MCP 重组质粒的提取及酶切鉴定  30-32
  3. 讨论  32-34
第三章大菱鲆（Scophthalmus maxims）脾细胞cDNA 文库的构建  34-48
  1. 材料与方法  34-42
    1.1 实验流程  34
    1.2 主要实验材料与试剂  34-35
    1.3 大菱鲆脾细胞总RNA 的提取和检测  35-36
    1.4 大菱鲆脾细胞mRNA 的分离与浓缩  36-37
    1.5 cDNA 第一链的合成  37
    1.6 dsDNA 的合成与纯化  37-38
    1.7 在dsDNA 5’端加上att81 接头  38-39
    1.8 dsDNA 产物的纯化及定量  39-40
    1.9 dsDNA 与pDONR222 载体的重组及扩增  40-41
    1.10 文库的鉴定  41-42
  2. 结果  42-46
    2.1 大菱鲆脾细胞总RNA 的提取及mRNA 的分离  42-43
    2.2 dsDNA 的合成  43
    2.3 cDNA 的纯化及定量  43-44
    2.4 cDNA 文库的构建及鉴定  44-46
  3. 讨论  46-48
第四章应用酵母双杂交技术筛选大菱鲆脾细胞cDNA 文库  48-71
  第一节 pDEST32-MCP 与pDEST22-cDNA 文库的酵母双杂交实验  48-57
    1. 材料与方法  48-52
      1.1 含pDEST32-MCP 诱饵质粒的酵母MaV203 的转化和筛选  48-50
      1.2 诱饵质粒的自激活性检测  50
      1.3 pDEST22-cDNA 文库的准备及酵母双杂交实验  50-52
    2. 结果  52-55
      2.1 MaV203 中MCP 的PCR 鉴定  52-53
      2.2 诱饵蛋白的自激活测试  53-54
      2.3 pDEST32-MCP 诱饵质粒与pDEST22-cDNA 文库质粒的酵母双杂交实验  54-55
    3. 讨论  55-57
  第二节阳性克隆的筛选鉴定及回复双杂交检测  57-71
    1. 材料与方法  57-59
      1.1 阳性克隆的筛选  57-58
      1.2 阳性克隆的鉴定  58
      1.3 cDNA 插入片段的测序  58
      1.4 cDNA 插入片段的生物信息学分析  58-59
      1.5 回复双杂交检测  59
    2. 结果与分析  59-68
      2.1 阳性克隆的表型确认  59-60
      2.2 以酵母质粒为模板的 PCR 鉴定  60-61
      2.3 以大肠杆菌质粒为模板的 PCR 鉴定  61-63
      2.4 cDNA 插入片段的测序结果  63-65
      2.5 DNA 序列分析  65
      2.6 蛋白序列分析  65-66
      2.7 回复双杂交检测结果  66-67
      2.8 2，3，4，25 号菌株质粒的鉴定  67
      2.9 2，3，4，25 号自激活检测  67-68
    3. 讨论  68-71
参考文献  71-76
附录  76-78
致谢  78

大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白与宿主蛋白的相互作用研究

内容摘要

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