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大菱鲆红体病虹彩病毒的流行情况调查及其主要衣壳蛋白在毕赤酵母中的重组表达

作　者: 吴成龙
导　师: 史成银；孔晓瑜
学　校: 中国海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 大菱鲆红体病虹彩病毒 大菱鲆病毒性红体病 流行情况调查 主要衣壳蛋白 真核表达
分类号: S943
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


自2001年以来由大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus, TRBIV)引发的大菱鲆病毒性红体病(viral reddish body syndrome of turbot, VRBS)在我国养殖大菱鲆中的流行日益严重,已成为制约着该养殖产业健康可持续发展的最严重的瓶颈因素之一。本研究利用已建立的PCR检测技术对TRBIV的流行情况进行了调查,调查结果显示:(1) TRBIV的流行已遍布山东半岛沿海地区,苗期、养成期和亲鱼期的大菱鲆均可感染TRBIV,VRBS已成为最严重的大菱鲆疾病之一。(2)养殖水温是影响该病发生的重要因素之一:在养殖水温高于18°C时,患病鱼的死亡率较高、临床症状明显,3个月内的累积死亡率高达90%以上;养殖水温低于18°C时,病毒主要以潜伏状态出现于症状不明显或无明显临床症状的大菱鲆体内,且感染鱼的死亡率较低。(3)调查发现养殖密度也是加重该病发生的因素之一,养殖密度偏高时感染鱼的死亡率明显增加。(4)利用TRBIV的PCR检测技术,发现除肌肉外大菱鲆的脑、鳃、心脏、肝脏、消化道、脾脏、肾脏、血液、性腺等均为TRBIV的敏感组织;(5)在大菱鲆亲鱼的性腺中检测到TRBIV的存在,因此,TRBIV的垂直传播途径需要深入调查和研究。本研究还根据TRBIV主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein, MCP)基因的全序列,利用Omiga2.0及Primer Premier5.0软件对其进行分析并设计其特异性引物。以本实验室构建的克隆质粒pUCm-T/TRBIV MCP为模板,扩增部分为TRBIV MCP全序列中的3 bp到1359 bp之间的区段(即去除了起始密码子ATG,终止密码子TAA后的区段),经PCR扩增得到一条约为1.4 Kb的特异性条带,将经过酶切后的PCR产物、表达载体pGAPZaA定向连接后电转导于E.coli DH5a(recA1 endA1),经过ZeocinTM初筛,PCR和双酶切检测,核酸序列测定后确定成功构建了重组质粒pGAPZaA/TRBIV-MCP。重组质粒pGAPZaA/TRBIV MCP经AvrⅡ酶切线性化后电转导于毕赤酵母X-33中,重组酵母经高浓度的ZeocinTM初筛,提取阳性酵母菌的基因组DNA,经PCR检测和鉴定后确定成功构建了阳性重组毕赤酵母。对阳性酵母小量发酵后,取其上清进行SDS-PAGE电泳检测及用anti-myc-HRP抗体进行Elisa-blot和Westen Blot检测,均检测到目的蛋白。另外又对其表达因素进行了初步探索和优化,为下一步阳性酵母菌的大量发酵,目的蛋白的大量制备,以便为研究TRBIV的宿主相互作用蛋白及TRBIV的免疫检测试剂打下了基础。

全文目录


摘要  6-8
Abstract  8-14
第一章. 文献综述  14-29
  第一节. 鱼类肿大细胞虹彩病毒病研究进展  14-26
    1. 感染鱼类的肿大细胞病毒属虹彩病毒及其地理分布  14-17
    2. 肿大细胞虹彩病毒的生物学研究  17-19
    3. 肿大细胞虹彩病毒感染引起的病鱼临床症状和组织病理变化  19-20
    4. 肿大细胞虹彩病毒的检测技术和细胞培养技术  20-22
    5. 肿大细胞虹彩病毒的传播途径研究  22-23
    6. 肿大细胞虹彩病毒对感染细胞的损伤机制  23
    7. 肿大细胞虹彩病毒的免疫防治研究  23-25
    8. 问题与展望  25-26
  第二节 鱼类虹彩病毒衣壳蛋白的研究现状  26-29
    1. 虹彩病毒衣壳蛋白在病毒结构与功能上的研究  26
    2. 虹彩病毒主要衣壳蛋白在病毒进化和分类上的研究与应用  26-27
    3. 虹彩病毒主要衣壳蛋白在病毒诊断上的应用  27
    4. 虹彩病毒主要衣壳蛋白在免疫防治上的研究与应用  27-28
    5. 虹彩病毒衣壳蛋白在病毒致病机制上的研究  28
    6. 展望  28-29
第二章. 大菱鲆病毒性红体病的流行情况调查及其诊断  29-42
  2.1 材料与方法  29-32
    2.1.1 材料  29-30
    2.1.2 方法  30-32
  2.2 结果  32-38
    2.2.1 患病大菱鲆的临床症状调查  32-33
    2.2.2 大菱鲆病毒性红体病的流行情况调查  33-35
    2.2.3 大菱鲆红体病虹彩病毒的PCR 检测结果  35
    2.2.4 大菱鲆红体病虹彩病毒感染宿主组织的调查  35-36
    2.2.5 TRBIV MCP 的PCR 产物测序分析鉴定  36-37
    2.2.6 关于TRBIV 的传播途径的初步调查  37-38
  2.3 讨论  38-41
    2.3.1 大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的流行情况  38-39
    2.3.2 大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的组织敏感性调查  39-40
    2.3.3 大菱鲆红体病虹彩病毒(TRBIV)的预防  40-41
  2.4 结语  41-42
第三章. TRBIV MCP 在毕赤酵母 X-33 中的重组表达  42-85
  第一节. TRBIV MCP 结构、功能及其分子生物学的初步分析  43-47
    1. 材料与方法  43
    2. 结果  43-45
      2.1 TRBIV MCP 基序(模序)位点的初步分析  43-44
      2.2 TRBIV MCP 序列抗原性、亲疏水性和跨膜区的分析  44-45
    3. 讨论  45-47
  第二节. TRBIV MCP 基因的真核表达载体的构建  47-72
    1. 实验材料  47
    2. 实验方法  47-59
      2.1 目的基因片段的制备  47-50
      2.2 载体pGAPZaA 的制备  50-51
      2.3 TRBIV MCP 的PCR 产物与载体pGAPZaA 的酶切  51-52
      2.4 酶切产物的纯化与定量  52
      2.5 TRBIV MCP 与线性pGAPZaA 的连接及其连接产物的纯化  52-54
      2.6 重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 的电转化及其扩增  54-55
      2.7 重组子的筛选与鉴定  55
      2.8 重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 目的片段的测序  55
      2.9 重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 的大量提取  55-56
      2.10 重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 的线性化、纯化及电泳鉴定  56-57
      2.11 线性化重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 电转导于酵母菌X-33  57-58
      2.12 阳性酵母转化子的筛选与鉴定  58-59
    3. 结果  59-68
      3.1 克隆质粒pUCm-T／TRBIV MCP 的提取结果  59
      3.2 引物设计的结果及其最佳复性温度的确定  59
      3.3 TRBIV MCP 目的基因片段的大量PCR 扩增及其纯化结果  59-60
      3.4 载体pGAPZaA 的提取、酶切效果  60
      3.5 线性载体pGAPZaA 和PCR 产物定量的结果  60-61
      3.6 重组质粒的电转化、阳性克隆的筛选及其转化效率  61
      3.7 阳性重组E.coli 的菌落PCR 检测与鉴定  61-62
      3.8 重组质粒pGAPZaA／TRBIV MCP 的提取结果  62-63
      3.9 重组质粒pGAPZaA／TRBIV-MCP 的酶切鉴定  63
      3.10 重组质粒pGAPZaA／TRBIV-MCP 目的片段的测序  63-65
      3.11 重组质粒pGAPZaA／TRBIV-MCP 的大量提取及其纯化  65
      3.12 重组质粒pGAPZaA／TRBIV-MCP 的线性化  65-66
      3.13 阳性酵母转化子的初步筛选及其转化效率  66
      3.14 阳性酵母转化子的基因组的提取及其PCR 鉴定  66-68
    4. 讨论  68-71
      4.1 选择分泌型真核表达载体pGAPZaA 的原因  68
      4.2 引物设计原则和目的基因序列测定  68
      4.3 重组表达载体的线性化  68-69
      4.4 选择电转化法的原因  69
      4.5 选择毕赤酵母表达系统的原因  69-71
      4.6 阳性重组毕赤酵母的检测与鉴定  71
    5. 结论  71-72
  第三节. TRBIV MCP 在毕赤酵母 X-33 中的表达  72-85
    1. 实验材料  72-73
    2. 实验方法  73-76
      2.1 含高拷贝目的基因的重组酵母的筛选  73
      2.2 高表达量重组酵母的筛选  73-74
      2.3 酵母的小量表达研究  74-75
      2.4 免疫印迹( Western-Blot )检测目的蛋白  75-76
      2.5 重组TRBIV MCP 的表达量与表达时间的研究  76
    3. 结果  76-82
      3.1 含高拷贝目的基因的重组酵母的筛选  76-77
      3.2 高表达量重组酵母的筛选  77-79
      3.3 重组酵母发酵上清的SDS-PAGE 检测  79-80
      3.4 重组酵母发酵上清的免疫印迹( Western-Blot )检测  80-81
      3.5 重组TRBIV MCP 的表达量与表达时间的研究  81-82
    4. 讨论  82-84
      4.1 高效表达阳性重组酵母克隆筛选技术的评价  82-83
      4.2 目的蛋白的检测及其表达量与表达时间的关系  83-84
    5. 小结  84-85
参考文献  85-95
附录1. TRBIV MCP 的PCR 扩增产物测序结果  95-96
附录2. 目的基因片段TRBIV MCP 所在的开放阅读框的测序结果  96-97
附录3. 真核表达载体pGAPZaA／TRBIV MCP 的构建流程  97-98
附录4. 本论文中所用试剂配方  98-102
致谢  102

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中图分类: > 农业科学 > 水产、渔业 > 水产保护学 > 各种鱼的病害、敌害及其防治
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