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含五元杂环磺胺类药物单克隆抗体的制备及初步应用

作　者: 吕芳
导　师: 王捍东
学　校: 扬州大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 磺胺类药物五元杂环半抗原单克隆抗体多残留检测 ELISA 鸡肉
分类号: S859.84
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

磺胺药是兽医临床上使用最广的一类化学合成抗菌药。动物性食品中磺胺类药物残留是国际国内食品卫生标准检测的重要项目。酶联免疫法(ELISA)具有特异性强、灵敏度高且适合大批样本快速测定的特点,在兽药残留检测中的应用日益广泛。目前针对单一磺胺药物残留的免疫检测已经取得了较多进展,而实现磺胺类药物的多残留免疫检测更具有实用价值。磺胺类药物种类繁多,结构复杂,要实现该类药物多残留酶免疫检测,首先需要获得识别谱广的族特异性抗体,其中最关键的步骤是合成具有磺胺母核结构的半抗原。根据磺胺共同结构中N1端R取代基的不同,可将其分为含五元杂环和六元杂环等不同类型。目前,尚未有人对磺胺五元杂环或六元杂环类药物多残留免疫分析进行过研究。本研究通过化学法合成了具有磺胺五元杂环类药物母核结构的人工抗原,制备了针对磺胺五元杂环类药物具有敏感性的单克隆抗体,建立了ELISA方法,并模拟检测了鸡肌肉中的多种混合磺胺药物残留,对磺胺药物多残留免疫分析的一些基本规律进行了探讨。用对乙酰氨基苯磺酰氯(ASC)和2-氨基-4-噻唑乙酸(ATAA)为反应原料,经过亲核取代、水解等反应,合成了具有磺胺噻唑衍生物结构的半抗原化合物TS,经质谱鉴定为预期产物。用EDC法将半抗原偶联到载体蛋白上,制备了人工抗原TS-HSA和TS-BSA。紫外扫描初步判定偶联成功,两种完全抗原H1-HSA、H1-BSA的结合比分别为44:1和21:1。采用常规免疫和脾内免疫两种方式,以TS-HSA免疫BALB/c小鼠,经比较发现,脾内免疫虽然可以节约免疫时间,但产生的抗血清无论在效价及与药物的特异性反应方面都不及常规免疫效果好,最终用常规免疫的小鼠进行细胞融合。经单克隆抗体技术筛选,获得1株可持续分泌针对磺胺五元杂环类药物抗体的杂交瘤细胞株,命名为3D3。制备了抗磺胺五元杂环类药物单抗的腹水,其效价达1:2,560,000,工作浓度达1:160,000;与青霉素、卡那霉素、阿米卡星、新霉素的交叉反应均在0.5%以下,与TS相似物对氨基苯甲酸、2-氨基-4-噻唑乙酸、对氨基苯磺酸、邻氯苯磺酰胺的交叉反应均小于1%。间接竞争ELISA(CiELISA)表明,4种磺胺五元杂环类药物ST、PST、SST、SMZ的IC50分别为268、176、340和2202ng/mL,检测限分别为14.4、6.3、18.2和33.88 ng/mL。将4中磺胺药物等浓度混合后,当混合药物浓度在5～1000ng/mL范围内,标准曲线方程为Y=0.3523x-0.1433,IC50为66.98 ng/mL,检测限达4.63ng/mL,均低于最高残留限量0.1μg/mL。用建立的CiELISA法,对鸡肌肉样品中添加的混合磺胺药物进行测定。当鸡肌肉样品处理液作8倍以上稀释时,样品基质干扰基本消失,且在5～5000ng/mL范围内,标准曲线方程为:Y=0.3229x-0.15,IC50为102.34ng/g,LOD为11.3ng/g。用100,1000,5000ng/mL的4种磺胺药物等浓度混合标准液做添加回收试验,经检测药物回收率在72.9%～100%之间,批内差异在2.56%～6.63%之间,批间差异在5.31%～9.72%之间。

全文目录

中文摘要  3-5
ABSTRACT  5-10
前言  10-22
  1 磺胺类药物概述  10-14
    1.1 磺胺类药物的基本特性  10-11
    1.2 磺胺类药物的结构  11-13
    1.3 磺胺类药物的毒性及不良反应  13-14
  2 磺胺类药物的残留检测  14-16
    2.1 磺胺类药物的限量标准  14
    2.2 磺胺类药物残留的检测  14-16
  3 磺胺类药物残留的酶免疫分析  16-19
    3.1 半抗原的设计与合成  16-17
    3.2 完全抗原的合成  17-18
    3.3 抗体的制备  18
    3.4 酶免疫分析方法  18-19
  4 磺胺类药物免疫残留检测的研究进展  19-20
    4.1 单个磺胺药检测的研究现状  19
    4.2 磺胺类药物多残留检测的研究现状  19-20
  5 本研究的目的及意义  20-22
第一部分磺胺五元杂环类药物人工抗原的制备  22-31
  1 材料与方法  22-25
    1.1 试剂  22
    1.2 仪器与材料  22-23
    1.3 主要溶液系统  23
    1.4 磺胺五元杂环类药物母核结构(TS)的合成与鉴定  23-24
    1.5 磺胺五元杂环类药物完全抗原的制备与鉴定  24-25
  2 结果  25-29
    2.1 TS 结构的鉴定  25-27
    2.2 完全抗原的鉴定  27-29
  3 讨论  29-31
    3.1 设计合成磺胺噻唑类衍生物TS 结构作为半抗原的原因  29
    3.2 半抗原TS 合成条件的摸索  29
    3.3 合成中利用TLC 监测的注意事项  29-30
    3.4 完全抗原的合成  30-31
第二部分磺胺五元杂环类药物单克隆抗体的制备及ELISA 方法的建立  31-46
  1 材料与方法  31-37
    1.1 试剂和药品  31
    1.2 仪器与耗材  31-32
    1.3 实验动物及生物材料  32
    1.4 主要溶液系统  32-33
    1.5 单克隆抗体的制备  33-35
    1.6 单克隆抗体性质的鉴定  35-36
    1.7 ELISA 检测方法的建立  36-37
  2 结果  37-42
    2.1 常规免疫与脾内免疫两种免疫方法的比较  37
    2.2 包被抗原工作浓度、阳性血清效价及最佳封闭液的确定  37-38
    2.3 单克隆抗体细胞株的建立及稳定性  38
    2.4 腹水的制备  38
    2.5 单克隆抗体的鉴定  38-39
    2.6 抗原抗体最佳工作浓度的确立  39-40
    2.7 CiELISA 标准工作曲线及相关参数  40-42
  3 讨论  42-46
    3.1 免疫方式的选择  42-43
    3.2 细胞培养及筛选  43-44
    3.3 封闭液的确立  44
    3.4 抗原抗体最佳工作浓度的确定  44
    3.5 获得的单抗对几种磺胺药物特异性及亲合性的分析  44-46
第三部分磺胺五元杂环类药物单抗的初步应用  46-51
  1 材料与方法  46-48
    1.1 材料  46
    1.2 仪器与试剂  46-47
    1.3 样品添加回收试验  47-48
  2 结果  48-49
    2.1 样品基质干扰  48
    2.2 样品溶液中标准曲线的绘制  48-49
    2.3 添加回收率及重复性  49
  3 讨论  49-51
结论  51-52
参考文献  52-56
致谢  56-57

含五元杂环磺胺类药物单克隆抗体的制备及初步应用

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