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原钙粘附蛋白（Protocadherin）18b在斑马鱼胚胎神经系统发育中的作用

作　者: 贡月波
导　师: 宋后燕
学　校: 复旦大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 斑马鱼 protocadherin18b 神经系统凋亡整体原位杂交锌指核酸酶
分类号: Q75
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

原钙粘附蛋白(protocadherin)是钙粘蛋白超家族中一个最大的亚族。钙粘附蛋白家族(cadherin family)为钙离子依赖型粘附分子,均为单链跨膜糖蛋白,介导特定组织或器官同型细胞间粘附,对胚胎发育中细胞识别、迁移、通讯和组织分化及中枢神经系统中神经回路的形成具有重要作用。原钙粘附蛋白在神经元发育和突触形成中有重要的作用。原钙粘附蛋白18(protocadherinl 8,Pcdh18)基因表达主要在小鼠的前脑、后脑脑室管膜区、嗅泡、大脑皮层、丘脑、及小脑中。斑马鱼Pcdhl8b则在神经管和中枢神经系统表达,其在神经系统发育中的作用及其分子机制尚不清楚。新兴模式生物斑马鱼胚胎透明、体外发育、个体小、繁殖率高、产卵周期长以及鱼种发育遗传背景清晰等优点使其正成为研究脊椎动物胚胎发育过程中基因功能的理想模式系统。2000年,Nasevicius等首次用吗啡啉修饰性寡核苷酸(MO)获得了目的基因表达下调的斑马鱼。从而建立了特异、快速、高效下调斑马鱼基因表达的重要技术,加快了基因功能研究的步伐。我们利用这种技术研究斑马鱼胚胎发育中pcdhl8b基因的功能,显示了独特优势。本文第一部分：利用生物信息学的方法证明在脊椎动物进化过程中Pcdh18分子的功能结构域保守。用反义RNA探针-全胚胎原位杂交和RT-PCR的方法研究pcdhl8b基因在斑马鱼胚胎发育早期的时空表达谱。本文第二部分：用靶向pcdhl8bmRNA的MO (pcdh18b-MO)干扰Pcdhl8b翻译起始,建立了pcdhl8b基因表达下调的斑马鱼模型。为了验证pcdh18b-MO的有效性,我们将其与编码pcdh18b-EGFP蛋白质的质粒DNA共注射,结果显示pcdh18b-MO抑制了pcdhl8b-EGFP蛋白的表达,从而也验证了pcdh18b-MO能够有效抑制内源性的pcdhl8b表达；并显示了pcdh18b-MO的特异性。本文第三部分：在胚胎整体发育水平上,我们运用胚胎整体原位杂交方法分析pcdh18基因表达下调后神经系统标志基因的表达以及脑部的表型,同时利用丫叮橙染色的方法检测脑部细胞凋亡情况。pcdhl8b下调使神经前体细胞的标志基因neurogl..神经元标志基因elav13和神经胶质细胞标志基因gfap的表达均出现下调,中后脑边界的标志基因pax2a和wnt1表达减弱并出现神经管分叉现象,同时与后脑分节相关的基因krox20表达减少。丫叮橙染色显示pcdhl8b下调后斑马鱼中脑、后脑及中后脑边界细胞凋亡增多.这些结果表明pcdhl8b基因表达下降导致斑马鱼神经系统发育的异常.本文第四部分：本部分利用J. Keith Joung采用的方式建立锌指库,设计并构建针对斑马鱼pcdhl8b基因的锌指核酸酶(pcdh18b-ZFN)载体,同时体外转录了pcdhl8b-ZFN mRNA。

全文目录

英文缩略词表  4-5
中文摘要  5-7
Abstract  7-9
前言  9-12
第一部分斑马鱼胚胎早期发育阶段pcdh18b基因表达谱研究  12-23
  引言  12
  1 材料与方法  12-18
  2 结果和讨论  18-22
  3 小结  22-23
第二部分 pcdh18b基因表达下调斑马鱼模型的建立  23-29
  引言  23
  1 材料和方法  23-26
  2 结果和讨论  26-28
  3 小结  28-29
第三部分 pcdh18b基因表达下调对斑马鱼神经系统发育的影响  29-37
  引言  29
  1 材料和方法  29-30
  2 结果和讨论  30-36
  3 小结  36-37
第四部分 pcdh18b-人工锌指核酸酶载体构建  37-56
  引言  37-38
  1 材料和方法  38-53
  2 结果和讨论  53-55
  3 小结  55-56
全文总结和展望  56-58
全文参考文献  58-61
综述  61-67
  参考文献  64-67
发表论文与获奖情况  67-68
致谢  68-69

原钙粘附蛋白（Protocadherin）18b在斑马鱼胚胎神经系统发育中的作用

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