学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析

作　者: 钱舟奇
导　师: 周永明
学　校: 华中农业大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 油菜拟南芥特异性启动子周期基因遗传转化 GUS
分类号: S565.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 273次
引　用: 2次
阅　读: 论文下载

内容摘要

本研究通过生物信息学方法获取了五个拟南芥特异性启动子信息,并通过同源序列分析获取了油菜基因组序列中两个完整和一个部分序列启动子序列。将这些启动子片段克隆并构建报告基因表达载体用于转化拟南芥进行功能验证,主要取得了以下四个方面的研究结果:1.拟南芥组织器官特异性启动子的克隆和功能验证根据拟南芥的基因组序列设计相应的引物,得到了五个特异性的启动子,将启动子与表达载体pBI121连接后,通过农杆菌介导的遗传转化,获得了一定数量的转化植株,经选择标记卡那霉素基因和目的基因的PCR分子检测,确认阳性苗中已插入目标基因,取T₁代植株材料GUS染色观察,发现分别在根、茎杆、叶片、角果、种子中特异表达。2.拟南芥组织器官特异性启动子驱动的Cycd3对植物生长的影响为了解特异性启动子驱动细胞周期基因对植物生长的影响,构建了3个特异性启动子驱动Cvcd3的表达载体,转化野生型拟南芥得到一批阳性苗,通过对T₁代植株的观察,发现其中有两个特异性启动子使植物体的生长发育发生的明显的变化,主要体现在生长时期的延迟。另外根特异性启动子驱动下表达CycD3后引起植株根部变小,生长滞后。3.油菜叶片特异性启动子克隆和功能验证在油菜基因组中得到两条完整的启动子片段,通过构建表达载体转化得到的阳性苗验证其功能,结果发现油菜中的同源序列与拟南芥启动子表达相一致,在相关叶片中有相应的表达。4.拟南芥茎杆特异启动子油菜同源片段的侧翼序列克隆根据对拟南芥茎杆特异性启动子序列比对油菜基因组数据库的结果,克隆得到一个1073bp的油菜基因组序列片段,利用加酶切接头的方法向3’端进行侧翼序列扩增得到3.4Kb的序列。通过与拟南芥序列对比分析发现含有两个同源性较高的区间,分别是靠近启动子上游A区的735bp（同源性74%）和靠近下游B区的133bp（同源性达到68%）。

全文目录

摘要  7-9
Abstract  9-11
缩略语表  11-13
1 前言  13-19
  1.1 植物启动子概述  13-17
    1.1.1 植物启动子的分类和特点  13-14
    1.1.2 植物启动子的研究方法及进展  14-17
  1.2 植物细胞周期基因简介  17-18
    1.2.1 植物细胞周期基因的类型  17
    1.2.2 细胞周期基因CycD3的特点  17-18
  1.3 本研究的目的意义  18
  1.4 本研究使用的技术路线  18-19
2 材料与方法  19-32
  2.1 实验材料  19-22
    2.1.1 植物材料  19
    2.1.2 主要试剂  19
    2.1.3 PCR反应的引物  19-21
    2.1.4 载体和菌株  21-22
  2.2 实验方法  22-32
    2.2.1 拟南芥基因组DNA的提取  22
    2.2.2 拟南芥组织器官特异性启动子片段的克隆及相关载体构建  22-26
      2.2.2.1 PCR反应体系及其程序  22-23
      2.2.2.2 PCR产物的回收纯化  23
      2.2.2.3 目的片段与T载体的连接、转化及鉴定  23-25
      2.2.2.4 启动子与表达载体pBI121的连接  25-26
    2.2.3 油菜基因组 DNA的提取  26
    2.2.4 油菜组织器官特异性启动子片段的克隆及相关载体构建  26-29
      2.2.4.1 油菜叶片特异性启动子片段的克隆及表达载体构建  26-27
      2.2.4.2 油菜茎杆特异性启动子片段的克隆及表达载体构建  27-29
    2.2.5 表达载体转化根癌农杆菌GV3101与鉴定  29-30
    2.2.6 农杆菌介导的拟南芥遗传转化  30-31
      2.2.6.1 拟南芥植株的培养  30
      2.2.6.2 拟南芥的农杆菌转化及其后期管理  30
      2.2.6.3 抗性植株的筛选  30-31
    2.2.7 转基因植株的分子检测以及GUS染色  31-32
      2.2.7.1 转基因植株的PCR检测  31
      2.2.7.2 转基因植物的GUS染色、成像、组织切片  31-32
3 结果与分析  32-43
  3.1 特异性启动子片段的生物信息学分析和相关克隆  32-34
    3.1.1 特异性启动子片段的生物信息学分析  32-33
    3.1.2 启动子目标片段的克隆  33-34
  3.2 转基因植株的鉴定  34-36
  3.3 GUS染色及部分横向切片结果  36-41
    3.3.1 拟南芥根特异性启动子表达分析  36-38
    3.3.2 拟南芥茎杆特异性启动子表达分析  38
    3.3.3 拟南芥角果特异性启动子表达分析  38-39
    3.3.4 拟南芥种子特异性启动子表达分析  39-40
    3.3.5 拟南芥叶片特异性启动子表达分析  40
    3.3.6 油菜叶片特异性启动子表达分析  40-41
  3.4 拟南芥特异性启动子驱动的CycD3突变体相关性状观察  41-42
  3.5 油菜茎杆特异性启动子侧翼序列的克隆和序列同源性分析  42-43
4 讨论  43-46
  4.1 特异性启动子表达的时空性  43
  4.2 叶片特异性启动子表达的相关问题  43-44
  4.3 特异性启动子序列区间的确定和分析  44
  4.4 拟南芥的生长状况对农杆菌介导的遗传转化效率的影响  44-46
参考文献  46-53
致谢  53-54
附录:相关试剂的配制  54-55

油菜和拟南芥组织器官特异性启动子克隆和功能分析

内容摘要

全文目录

相似论文