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驱动蛋白EG5在人类CML白血病中的作用及其靶向药物S-Trityl-L-Cysteine抗白血病作用机制研究

作　者: 王伦善
导　师: 王保龙
学　校: 安徽医科大学
专　业: 临床检验诊断学
关键词: 驱动蛋白 EG5 BCR/ABL 融合基因 S-三苯甲基-L-半胱氨酸 HL-60细胞系 K562细胞系 有丝分裂阻滞 凋亡
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要


研究目的:一、观察驱动蛋白EG5 mRNA在正常人外周血和骨髓中的表达情况,探讨其在各期CML中的表达及和BCR/ABL mRNA表达相关性,评估EG5 mRNA在CML诊断和预后分析中的潜在应用价值。二、研究S-三苯甲基-L-半胱氨酸(S-Trityl-L-Cysteine,STLC)对急性白血病HL-60细胞有丝分裂阻滞和凋亡的影响,初步探讨药物作用下HL-60细胞有丝分裂阻滞和凋亡间的因果关系。三、研究S-三苯甲基-L-半胱氨酸(S-Trityl-L-Cysteine,STLC)对慢性粒细胞白血病(Chronic Myeloid Leukemia,CML)K562细胞有丝分裂阻滞和凋亡的影响,探讨药物阻滞和凋亡机制及Eg5与bcr/abl信号通路联系。研究方法:一、采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测EG5 mRNA和筑巢式逆转录聚合酶链反应(Nested-RT-PCR)检测BCR/ABL mRNA,分别对8例正常人外周血及骨髓样本和62例慢粒患者的外周血样本进行检测。二、将HL-60细胞分成不加药对照组和不同剂量(1、2.5、5、10、50、100μmol/L) STLC加药组,药物作用一定时间后,台盼兰染色观察HL-60细胞活性变化, MTT法检测其对HL-60细胞的抑制效应,免疫荧光染色观察细胞及其核的特征,流式细胞术分析细胞周期和亚二倍体峰的变化,Annexin-v/PI双染检测药物处理前后正常骨髓细胞凋亡比率。三、将K562细胞分成不加药对照组和不同剂量STLC加药组,药物作用一定时间后, MTT法检测其对K562细胞的抑制效应,流式细胞术分析细胞周期和亚二倍体峰的变化,Annexin-v/PI双染检测药物处理前后细胞凋亡比率,共聚焦显微镜观察纺锤体与细胞核空间位置关系及促凋亡分子AIF位移情况,小分子抑制剂阻断结合RT-PCR研究Eg5与bcr/abl信号通路联系。研究结果:一、正常外周血标本中未检测到EG5的表达,正常骨髓标本中可见EG5的低丰度表达;EG5辅助诊断CML的敏感度和特异性分别为89.6%(26/29)和84.8%(28/33);BCR/ABL融合基因诊断CML的敏感度和特异性分别为96.5%(28/29)和90.9%(30/33);慢粒中EG5和BCR/ABL的表达无显著性差别,且二者之间呈高度正相关。二、MTT和台盼兰染色实验显示STLC抑制HL-60细胞生长并致其死亡;免疫荧光染色见核破裂及凋亡小体和细胞体积增大等典型有丝分裂灾变细胞凋亡现象;细胞周期和凋亡分析表明STLC致HL-60细胞凋亡比率与药物浓度和作用时间呈正相关,致G2/M期阻滞比率24小时和48小时随药物浓度增加而升高,而72小时无明显变化,进一步研究发现STLC处理早期即可致G2/M期有丝分裂阻滞和凋亡的同时发生,撤除药物作用后有丝分裂阻滞呈可逆性恢复,STLC作用下正常骨髓细胞凋亡比率无明显变化。三、实验显示STLC显著抑制K562细胞生长;药物处理早期可阻滞细胞周期进程于G2/M期,且85.5%细胞纺锤体结构呈单星状排列;处理晚期可致细胞凋亡且不依赖于AIF的参与; K562细胞中Eg5表达由bcr/abl酪氨酸激酶所调节。研究结论:一、EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病疾病进展中的表达情况基本一致,EG5和BCR/ABL的联合检测及动态观察,可以作为慢粒临床辅助诊断、疗效和预后判断的指标之一。二、STLC诱导HL-60细胞阻滞在G2/M期并致其凋亡,显示较强的抗有丝分裂和抗肿瘤效果,药物处理早期有丝分裂阻滞和凋亡同时发生提示尚有该药物作用新机制的存在。三、STLC诱导K562细胞阻滞在G2/M期并致其凋亡,但不依赖于AIF的存在,显示较强的抗有丝分裂和抗肿瘤效果。

全文目录


英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-9
英文摘要  9-13
前言  13-15
材料和方法  15-22
研究一 EG5和BCR/ABL在慢性粒细胞白血病中表达及其临床意义  22-24
  结果  22-23
  讨论  23-24
研究二 S-Trityl-L-Cystein 诱导 HL-60 细胞有丝分裂阻滞和凋亡  24-31
  结果  24-29
  讨论  29-31
研究三 S-Trityl-L-Cysteine 诱导 K562 细胞有丝分裂及阻滞  31-36
  结果  31-34
  讨论  34-36
结论  36-37
进一步研究的方向  37
参考文献  37-40
附录  40-41
致谢  41-42
综述  42-52
  参考文献  50-52

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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