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不同类型和处理对绵羊体细胞及克隆胚组蛋白乙酰化水平的影响

作　者: 姚雅馨
导　师: 张勇；关伟军
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 临床兽医学
关键词: 绵羊成纤维细胞卵丘/颗粒细胞乙酰化核移植重编程
分类号: Q813
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

体细胞核移入去核的卵母细胞后,必定要经过表观遗传修饰的重编程过程。对供体细胞进行不同的处理,会导致克隆胚胎重编程能力和程度的不同。本研究利用Trichostatin A(TSA)、Roscovitine(ROS)、血清饥饿和接触抑制等方法分别处理绵羊成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞,检测两种细胞处理前后细胞乙酰化水平、周期分布及其对重组胚发育水平的影响,检测激活前克隆胚胎的乙酰化水平,比较正常发育的体外受精胚胎,克隆胚胎,供体细胞经TSA处理的克隆胚胎的发育及其乙酰化水平变化,为提高核移植效率提供理论基础。研究结果表明:1.成纤维细胞对TSA的耐受性较好,细胞虽呈现扁平的趋势,但与对照组区别并不明显;而颗粒细胞对TSA的耐受性较差,经TSA处理的颗粒细胞的活率明显低于成纤维细胞细胞。两种细胞经不同浓度TSA处理后的乙酰化水平均较对照组明显增高。观察细胞形态,考虑细胞活率,参考细胞乙酰化变化,只有当TSA浓度维持在10ng/mL时较为适合作为两种细胞的处理浓度。2.利用TSA、ROS、血清饥饿和接触抑制等方法分别处理成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞后,细胞形态良好,活率保持在94%以上。TSA处理成纤维细胞和卵丘/颗粒细胞后,其乙酰化水平较对照组和其他处理组明显增加(P<0.05),经ROS处理的细胞乙酰化表达水平同样高于对照组(P<0.05),但仍低于TSA处理组(P<0.05),但经血清饥饿处理的细胞乙酰化水平较对照组明显降低(P<0.05);两种类型细胞的乙酰化水平经荧光定量分析后,我们发现未经处理的颗粒细胞本身具有的乙酰化水平明显高于成纤维细胞,颗粒细胞经不同处理的乙酰化水平也相应地高于成纤维细胞;并且利用TSA处理成纤维细胞和卵丘/颗粒24h后,两种细胞均被明显抑制在G0/G1期,且较其他处理组的抑制现象更加明显(P<0.05)。3.经TSA处理后的成纤维细胞充当供体细胞,其卵裂率和囊胚率较对照组明显增加(P<0.05, 81.2±3.4% vs 57.3±8.9%; 28.2±6.3% vs 7.1±7.6%) ,并且其他处理组的克隆胚胎发育水平也同样得到了提高。相反,颗粒细胞TSA处理组的克隆胚胎卵裂率和囊胚率不但没有升高反而降低。4.两类细胞经TSA处理的激活前克隆胚胎乙酰化水平较对照组和其他处理组明显升高(P < 0.05),而血清饥饿处理组的乙酰化荧光强度明显低于对照组(P < 0.05)。颗粒细胞作为供体细胞的重构胚中,除TSA外,其他处理组与对照组之间的乙酰化水平差异不显著(P> 0.05);而未经处理的颗粒细胞的克隆胚明显高于未经处理的成纤维细胞克隆胚的乙酰化水平(P < 0.05)。5.每组克隆胚胎的乙酰化分布都照正常的体外受精胚胎不同,分布情况被打乱,这表明表观遗传修饰的重编程过程在克隆胚胎中是不完全的,无序的,而利用TSA处理供体细胞可以在一定程度上“纠正”但并不能完全“纠正”克隆胚胎的重编程的过程。

全文目录

摘要  6-8
Summary  8-14
第一部分文献综述:体细胞克隆的表观遗传研究进展  14-30
  一、供体细胞的选择  15-18
    1 不同类型的供体细胞对重编程的影响  15-16
    2 不同周期的供体细胞对重编程的影响  16
    3 不同代数的供体细胞对重编程的影响  16-17
    4 不同年龄的供体细胞对重编程的影响  17
    5 不同物种的供体细胞对重编程的影响  17-18
  二、供体细胞的处理  18-20
    1 供体细胞的冷冻保存  18
    2 供体细胞的血清饥饿处理及离子霉素激活  18-19
    3 利用促重编程试剂处理供体细胞  19-20
  三、动物胚胎的表观遗传修饰  20-30
    1 DNA 甲基化与去甲基化  21-22
      1.1 DNA 甲基化  21
      1.2 DNA 甲基化对胚胎发育情况的影响  21-22
      1.3 DNA 去甲基化  22
    2 组蛋白修饰作用  22-26
      2.1 组蛋白甲基化  23
      2.2 组蛋白甲基化与DNA 甲基化的关系  23-24
      2.3 组蛋白乙酰化作用  24
      2.4 DNA 甲基化与组蛋白乙酰化关系  24-26
      2.5 组蛋白磷酸化研究现状及发展动态  26
    3 X 染色体失活的研究现状及发展动态  26-27
    4 基因组印迹研究现状及发展动态  27-28
    5 端粒维持的研究现状及发展动态  28-30
第二部分试验部分  30-62
  试验一、TSA 对绵羊卵丘/颗粒细胞和成纤维细胞的影响  30-42
    1 材料  31-33
      1.1 试验材料  31-33
        1.1.1 动物材料来源  31
        1.1.2 主要试剂  31
        1.1.3 试剂的配制  31-32
        1.1.4 主要仪器及耗材  32-33
    2 试验方法  33-35
      2.1 供体细胞系的建立  33-34
        2.1.1 绵羊卵丘/颗粒细胞系的建立  33-34
        2.1.2 滩羊成纤维细胞的复苏与培养  34
      2.2 不同浓度TSA 对供体细胞形态与活率的影响  34
      2.3 间接免疫荧光法检测不同浓度TSA 对供体细胞乙酰化水平的影响  34-35
      2.4 数据统计  35
    3 结果  35-40
      3.1 不同浓度TSA 对绵羊卵丘/颗粒细胞和成纤维细胞形态的影响  35-36
      3.2 不同浓度TSA 对绵羊卵丘/颗粒细胞和成纤维细胞活率的影响  36-37
      3.3 不同浓度TSA 对绵羊卵丘/颗粒细胞和成纤维细胞乙酰化的影响  37-40
    4 讨论  40-42
  试验二、供体细胞的不同处理对其重编程能力的影响  42-56
    1 材料  42-44
      1.1 试验材料  42-44
        1.1.1 动物材料来源  42
        1.1.2 主要试剂  42-43
        1.1.3 试剂的配制  43
        1.1.4 主要仪器及耗材  43-44
    2 试验方法  44-46
      2.1 卵母细胞的成熟培养  44
      2.2 供体细胞的准备  44
      2.3 核移植  44
      2.4 核移植胚的激活及培养  44-45
      2.5 试验设计  45-46
        2.5.1 细胞形态与活率检测  45
        2.5.2 乙酰化抗体荧光标记  45
        2.5.3 周期检测  45-46
        2.5.4 克隆胚胎乙酰化水平检测  46
      2.6 数据统计  46
    3 结果  46-54
      3.1 不同处理方法对卵丘/颗粒细胞和成纤维细胞形态影响  46-47
      3.2 TSA，ROS，血清饥饿，接触抑制对颗粒细胞乙酰化水平的影响  47-50
      3.3 不同处理方法对卵丘/颗粒和成纤维细胞周期的影响  50-51
      3.4 不同处理方法对克隆胚发育水平的影响  51-52
      3.5 供体细胞经不同处理的激活前重构胚乙酰化水平  52-54
    4 讨论  54-56
  试验三、TSA 对早期克隆胚胎乙酰化变化模式的影响  56-62
    1 材料  56
      1.1 主要仪器及器具  56
      1.2 主要试剂  56
      1.3 试剂的配制  56
    2 方法  56-58
      2.1 供体细胞的准备方法  56-57
      2.2 受体卵母细胞的准备方法  57
      2.3 卵母细胞体外受精及培养  57
      2.4 核移植方法  57
      2.5 核移植胚的激活及培养  57
      2.6 试验设计  57
        2.6.1 不同胚胎发育水平的比较  57
        2.6.2 不同胚胎乙酰化水平的比较  57
      2.7 数据分析  57-58
    3 结果  58-60
      3.1 不同胚胎的体外发育水平  58
      3.2 体外受精胚胎和克隆胚胎的各个阶段组蛋白乙酰化变化模式  58-60
    4 讨论  60-62
第三部分结论  62-63
参考文献  63-70
致谢  70-71
作者简介  71-72
导师简介  72-73

不同类型和处理对绵羊体细胞及克隆胚组蛋白乙酰化水平的影响

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