目的和意义造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation ,HSCT)是根治多种恶性血液病的唯一手段。但由于患者找到同胞全相合供者的几率只有25%,而非血缘供者移植则存在找到相合供者的机会有限、等待时间长等问题,因此,应用单倍体相合的亲缘供者作为干细胞移植供者来源进行造血干细胞移植,已成为近年来治疗恶性血液病的有效方法。相对同胞全相合移植,单倍体相合供者造血干细胞移植(haploidentical hematopoietic stem cell transplantation,haplo-HSCT)的主要障碍是移植物抗宿主病(Graft-versus-host disease,GVHD)的发病率较高,据报道,haplo-HSCT后急慢性GVHD的发生率高达50%~80%,移植相关死亡率约30%,严重影响患者的生存时间和生存质量,其中尤其是急性GVHD的高发生率仍是影响移植患者生存率、术后生存质量和阻碍异基因造血干细胞移植广泛应用的主要原因。对于haplo-HSCT移植后GVHD的防治问题是近年临床移植研究领域的热点。目前国外采取的主要预防GVHD措施包括体外去除T细胞,CD34分选等,国内主要采取增加预处理的强度、强烈的免疫抑制及提高输入的CD34+细胞数量等方法,但都存在感染发生率高,移植后复发率高,移植相关死亡率高等缺点。因此,近年来,细胞治疗成为预防和治疗GVHD实验研究和临床应用热点,其中骨髓来源的间充质干细胞预防GVHD的效果已经得到广泛认可,其作用机制在于可以稳定造血微环境,调节免疫,调节造血细胞生长等。骨髓造血微环境主要由骨髓基质细胞、细胞外基质(extracellular matrix,ECM)以及多种造血生长因子组成,其中,细胞外基质(ECM)及其相关的细胞粘附分子(celladhesion molecules,CAMs)是形成造血细胞间以及造血细胞与基质细胞间相互作用的基础。目前研究证实,造血干细胞移植预处理和/或疾病本身因素引起的患者的造血微环境损伤参与了GVHD的发生和发展,而近年的研究表明,移植过程中输注间充质干细胞可以通过修复造血微环境损伤及调节免疫功能等作用减轻或控制GVHD。因此通过调控造血微环境可望调节GVHD。碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是一种分子量为18000--24000的碱性多肽,基因具有高度保守性,人、牛、鼠的FGF-2核苷酸序列高度同源,均为单拷贝基因。人源性bFGF基因定位于染色体4q27,是成纤维细胞生长因子蛋白(fibroblast growth factors,FGFs)家族中的一员。bFGF能刺激和调节血管内皮细胞、上皮细胞、成肌细胞、成骨细胞和神经胶质细胞等多种起源于中胚层、神经外胚层细胞的增殖和分化,不仅能促进血管生成和神经细胞修复,还通过协同其他造血生长因子来增强造血细胞体外克隆的形成,体外研究表明碱性成纤维细胞生长因子在体外培养过程中可刺激间充质干细胞增殖、稳定造血微环境,且其同家族的酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor,aFGF)已证实可以调节GVHD,但目前国内外尚未见bFGF能否在体内促进间充质干细胞增殖以及与GVHD的相关性报道,本课题拟从bFGF体内促进间充质干细胞增殖,稳定造血微环境入手,首先建立小鼠MHC单倍体骨髓移植模型,然后观察bFGF干预的效果,研究bFGF能否调节GVHD以及初步探讨其可能的机制。材料和方法1.建立小鼠单倍体MHC骨髓移植模型(1)雄性C57BL/6(H-2b)作为供鼠,雌性BALB/c(H-2d)小鼠与雄性C57BL/ 6(H-2b)小鼠的雌性杂交后代(BALB/c×C57BL/6) F1 (简称为CB6F1)作为受鼠,从而建立C57BL/6 (H-2b)→CB6F1(H-2d/b) MHC单倍体移植小鼠模型。(2)骨髓移植前预处理:利用Co60给予受鼠9-10Gy全身照射,剂量率0.5Gy/ min,照射源与动物之间距离约为50cm。(3)制备移植细胞:取C57BL/6雄性小鼠作为供者,断颈处死,剪开小鼠股骨、胫骨的干骺端,用注射器冲洗出骨髓腔内的骨髓细胞,制成骨髓细胞悬液(3.0×106/ml),剪碎脾脏,制备脾细胞悬液(2.0×107/ml),将骨髓细胞悬液和脾脏细胞悬液等体积混合。(4)骨髓移植方法:受鼠接受照射后4h,经尾静脉注射脾细胞和骨髓细胞混合悬液0.3ml,其中骨髓细胞约4.5×106/个,脾细胞约3×107/个。2. bFGF调节GVHD以及机制研究(1)不采用任何预防GVHD措施组(A组):观察移植后体重,食欲,外观,腹泻,出血或粘膜炎症以及外周血白细胞计数,生存期及肝脏、皮肤、肠道病理学检查(2)bFGF高剂量干预组(B组):移植0天开始,骨髓和脾细胞输入后4小时给予bFGF 100ug/Kg皮下注射,每日1次,观察移植后体重,食欲,外观,腹泻,出血或粘膜炎症以及外周血白细胞计数,生存期及肝脏、皮肤、肠道病理学检查,流式细胞术检测MSC的CD31、CD44表达。(3)bFGF低剂量干预组(C组):移植0天开始,骨髓和脾细胞输入后4小时给予bFGF 20ug/Kg皮下注射,每日1次,观察移植后体重,食欲,外观,腹泻,出血或粘膜炎症以及外周血白细胞计数,生存期及病理学检查,流式细胞术检测MSC的CD31、CD44表达。(4)观察各组GVHD临床表现、生存时间、病理表现差别。(5)移植+14天,断颈处死各组小鼠,取小鼠四肢股骨骨髓进行骨髓间充质干细胞培养,通过光镜观察以及流式细胞检测细胞培养结果,确定是否为间充质干细胞增殖及各组间充质干细胞增殖差别,并进行间充质干细胞成骨诱导分化和成脂肪诱导分化。结果1.成功建立小鼠单倍体造血干细胞移植模型2.小鼠生存情况:A组于移植后11天开始出现小鼠死亡,17天内完全死亡,B组于移植后15天开始出现小鼠死亡,B组生存超过30天有2只,C组于移植后13天开始出现小鼠死亡,19天内完全死亡。从绘制的Kaplan -Meier生存期曲线来看,A组和C组生存曲线无明显差别(P>0.05),与B组生存率具有显著差异(P<0.05)。3. GVHD临床表现:移植后A组白细胞下降速度较快,但移植15d时白细胞仍>0.5×109/L,而B组和C组下降速度较慢;移植后第7天B、C组体重下降程度低于A组(P<0.05),移植14天B组体重下降程度低于A组(P<0.05),而C组和A组无明显统计学差别(P>0.05);B组发生腹泻,弓背、脱毛等GVHD临床表现情况晚于A组和C组。4.组织病理学检查:大体标本可见局灶性出血,镜下A组肝脏组织切片HE染色可见组织结构破坏,分叶核细胞和淋巴细胞浸润增多,以及大量局灶性出血,而B组和C组淋巴细胞浸润程度和出血程度均轻于A组。5.骨髓间充质干细胞培养:移植后14天进行骨髓间充质干细胞培养,结果显示,A组和C组细胞稀少,不能形成集落和继续生长,而B组可见大量细胞集落和生长良好的细胞,光镜观察,B组生长良好的细胞镜下细胞贴壁,形态呈长梭状,细胞核紧密团结。B组流式细胞结果提示CD31呈阴性表达和CD44呈阳性表达。并且该组细胞可诱导分化为成骨细胞和成脂肪细胞。结论1.体内应用碱性成纤维细胞因子(bFGF)可以明显减轻预处理对骨髓微环境的损伤,稳定造血微环境,促进单倍体造血干细胞移植后小鼠存活;2.碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)可起到减轻小鼠MHC单倍体移植后GVHD作用,但其单独应用预防和治疗GVHD的效果有限;3.本研究提示碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)减轻小鼠GVHD作用的机制,可能是通过刺激间充质干细胞体内增殖而发挥免疫调节作用。
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