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引起细胞凋亡的瑞士乳杆菌9的高密度培养研究

作　者: 廖玲
导　师: 张柏林
学　校: 北京林业大学
专　业: 农产品加工与贮藏工程
关键词: 瑞士乳杆菌9 酪蛋白水解物 细胞凋亡 Caco-2细胞 IEC-6细胞 高密度培养
分类号: TS201.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 88次
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内容摘要


瑞士乳杆菌9（Lactobacillus helveticus 9）筛选于中国新疆传统干酪食品奶疙瘩中,基于体外肠细胞培养模型,当仅仅将瑞士乳杆菌9菌体细胞与酪蛋白在37。C共培养,则获得的细胞水解产物被证实具有良好的调节肠细胞（Caco-2细胞株和IEC-6细胞株）生长的作用;鉴于获得更多酪蛋白水解产物的前提是获得大量的瑞士乳杆菌细胞,本文又进一步开展了瑞士乳杆菌9高密度细胞培养技术研究,旨在为瑞士乳杆菌9的大规模生产应用提供理论基础。主要结果如下:1、酪蛋白水解产物对Caco-2细胞和IEC-6细胞增殖影响研究表明,瑞士乳杆菌9的酪蛋白水解产物具有一定降低肠细胞增殖与诱导肿瘤细胞凋亡的功效,这样的功效具有剂量效应和纯度效应。6.67mg/mL的F3组分对Caco-2细胞增殖的抑制率达到20.89%,对IEC-6细胞增殖无明显抑制。组分F3-1-1在3.33mg/mL浓度时,对Caco-2细胞增殖抑制率为46.46%,而对IEC-6细胞增殖抑制率仅为9.59%。2、采用剂量3.33mg/mL的酪蛋白水解产物F3-1-1组分作用于2株肠细胞后,用苏木精-伊红（HE）染色法可以观察到凋亡细胞的核染色质呈现固缩或边集现象,细胞核呈致密浓染,出现了凋亡小体;用吖啶橙/溴化乙锭（AO-EB）染色也可观察到具有染色质固缩的凋亡细胞,但IEC-6细胞株的凋亡效果远不如Caco-2的凋亡效果明显。3、DNA末端原位标记染色法（TUNNEL）测定结果表明,采用3.33mg/mL剂量的酪蛋白水解产物组分F3-1-1能诱导Caco-2细胞凋亡,凋亡率为14.93%;对LEC-6细胞诱导凋亡效果不明显。4、流式细胞术（FCM）检测细胞凋亡和DNA含量变化研究表明,采用3.33mg/mL剂量的酪蛋白水解产物组分F3-1-1能诱导Caco-2凋亡,在G0/G1峰前出现亚二倍体峰,即凋亡峰,凋亡率为31.46%;也可以诱导IEC-6的凋亡,凋亡率为7.9%。显然,瑞士乳杆菌9细胞的酪蛋白水解产物具有抑制肠细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的生物活性。5、瑞士乳杆菌9水解酪蛋白获取生物活性肽的过程中,细胞数量（或接种量）与酪蛋白水解度呈显著相关性。瑞士乳杆菌9的高密度培养受到培养温度、起始pH值、接种量和培养基成分（碳源、氮源、缓冲盐、番茄汁含量）的影响,其适宜的培养条件为:培养温度为37。C,起始pH为6.5,接种量为5%。瑞士乳杆菌9的适宜增殖培养基是脱脂乳10%、葡萄糖1.0%、大豆蛋白胨1.0%、乙酸钠0.5%和番茄汁18%。6、基于优化的培养基及合适环境条件,瑞士乳杆菌9在37℃培养10h后,活菌数为1.70×109CFU/mL,较对照的活菌数提高了一个数量级;进一步地对瑞士乳杆菌9进行16L发酵罐高密度培养10h后,其活菌数达到3.59×109CFU/mL。这些数据对实现瑞士乳杆菌9的大规模培养以及获取乳源活性肽提供了理论和技术支持。

全文目录


摘要  3-5
Abstract  5-11
1 文献综述  11-23
  1.1 乳源活性肽对细胞的生长调节作用  11-14
    1.1.1 凋亡诱导肽  11-14
    1.1.2 细胞生长刺激肽  14
  1.2 乳源活性肽的来源  14-16
    1.2.1 酶解  14-15
    1.2.2 微生物发酵法  15
    1.2.3 化学合成法  15
    1.2.4 采用基因工程技术  15-16
  1.3 乳酸菌细胞高密度培养研究  16-22
    1.3.1 高密度培养的定义  16
    1.3.2 影响乳酸菌高密度培养的因素  16-19
      1.3.2.1 环境因素的影响  16-17
      1.3.2.2 培养基组成的影响  17-19
    1.3.3 高密度培养的原理  19
    1.3.4 培养方法  19-22
      1.3.4.1 化学中和法  19-20
      1.3.4.2 缓冲盐法  20-21
      1.3.4.3 透析培养  21
      1.3.4.4 膜过滤培养  21
      1.3.4.5 补料分批培养  21-22
  1.4 本项研究目标  22-23
2 瑞士乳杆菌9酪蛋白水解产物调节肠细胞生长作用的研究  23-47
  2.1 引言  23
  2.2 实验材料  23-26
    2.2.1 瑞士乳杆菌9酪蛋白水解产物的来源  23-25
      2.2.1.1 瑞士乳杆菌9的特性  23
      2.2.1.2 瑞士乳杆菌9的酪蛋白水解产物的制备工艺  23-24
      2.2.1.3 酪蛋白水解产物的分离纯化  24-25
    2.2.2 实验对象  25
    2.2.3 主要试剂  25-26
    2.2.4 主要仪器  26
  2.3 实验方法  26-31
    2.3.1 细胞培养与传代  26-27
      2.3.1.1 IEC-6细胞的培养与传代  27
      2.3.1.2 Caco-2细胞的培养与传代  27
    2.3.2 细胞生长曲线的绘制  27
      2.3.2.1 IEC-6细胞的生长曲线绘制  27
      2.3.2.2 Caco-2细胞的生长曲线绘制  27
    2.3.3 MTT法检测酪蛋白水解产物对细胞生长的影响  27
    2.3.4 细胞形态学观察  27-28
      2.3.4.1 倒置显微镜下观察  27-28
      2.3.4.2 苏木精-伊红法染色  28
      2.3.4.3 AO-EB染色  28
    2.3.S TUNEL法检测细胞凋亡  28-30
      2.3.5.1 实验原理  28-29
      2.3.5.2 Tunnel细胞样品的处理方法  29
      2.3.5.3 实验步骤  29
      2.3.5.4 阳性对照的实验步骤  29-30
    2.3.6 凋亡细胞的琼脂糖凝胶电泳检测  30
      2.3.6.1 凋亡细胞DNA Ladder提取  30
      2.3.6.2 琼脂糖凝胶电泳检测  30
    2.3.7 流式细胞法检测细胞凋亡  30-31
  2.4 结果与分析  31-43
    2.4.1 细胞的生长曲线  31-32
      2.4.1.1 IEC-6细胞的生长曲线  31
      2.4.1.2 Caco-2细胞的生长曲线  31-32
    2.4.2 酪蛋白水解产物对肠细胞增殖的影响  32-33
      2.4.2.1 超滤产物对肠细胞的影响  32-33
      2.4.2.2 F3-1-1组分对肠细胞增殖的影响  33
    2.4.3 凋亡细胞的形态  33-37
      2.4.3.1 倒置显微镜下细胞形态  33-34
      2.4.3.2 苏木精-伊红法染色结果  34-36
      2.4.3.3 AO-EB染色结果  36-37
    2.4.4 TUNEL法检测结果  37-40
    2.4.5 琼脂糖凝胶电泳结果  40-41
    2.4.6 流式细胞仪法检测结果  41-43
  2.5 讨论与小结  43-47
3 瑞士乳杆菌9的高密度培养的研究  47-61
  3.1 引言  47
  3.2 实验材料  47-48
    3.2.1 菌株及来源  47
    3.2.2 培养基  47
    3.2.3 培养条件  47-48
    3.2.4 主要试剂  48
    3.2.5 主要仪器  48
  3.3 实验方法  48-50
    3.3.1 菌体浓度的测定  48
      3.3.1.1 乳酸菌活菌计数  48
      3.3.1.2 分光光度法测定菌体浓度  48
    3.3.2 酸度的测定  48
    3.3.3 pH值的测定  48-49
    3.3.4 瑞士乳杆菌9生长曲线的测定  49
    3.3.5 瑞士乳杆菌9培养条件的优化  49
      3.3.5.1 温度的确定  49
      3.3.5.2 初始pH值的确定  49
      3.3.5.3 接种量的确定  49
      3.3.5.4 培养方式的确定  49
    3.3.6 瑞士乳杆菌9培养基的优化  49-50
      3.3.6.1 碳源的确定  49
      3.3.6.2 氮源的确定  49
      3.3.6.3 缓冲盐的确定  49-50
      3.3.6.4 番茄汁含量的确定  50
      3.3.6.5 增殖培养基的正交优化  50
    3.3.7 化学中和法增菌试验  50
    3.3.8 16L发酵罐试验  50
  3.4 结果与分析  50-59
    3.4.1 瑞士乳杆菌9的生长曲线  50-51
    3.4.2 培养条件的优化  51-54
      3.4.2.1 温度对瑞士乳杆菌9生长的影响  51-52
      3.4.2.2 起始pH值对瑞士乳杆菌9生长的影响  52-53
      3.4.2.3 接种量对瑞士乳杆菌9生长的影响  53
      3.4.2.4 不同培养方式对瑞士乳杆菌9生长的影响  53-54
    3.4.3 培养基的优化  54-57
      3.4.3.1 不同碳源对瑞士乳杆菌9生长的影响  54
      3.4.3.2 不同氮源对瑞士乳杆菌9生长的影响  54-55
      3.4.3.3 不同缓冲盐对瑞士乳杆菌9生长的影响  55
      3.4.3.4 不同番茄汁含量对瑞士乳杆菌9生长的影响  55-56
      3.4.3.5 发酵培养基的正交优化  56-57
    3.4.4 化学中和法增菌结果  57-58
    3.4.5 16L发酵罐实验结果  58-59
  3.5 小结  59-61
4 结论  61-63
  4.1 瑞士乳杆菌9细胞酪蛋白水解产物对肠细胞生长有影响  61
  4.2 瑞士乳杆菌9的高密度培养结果  61-63
参考文献  63-67
个人简介  67-69
导师简介  69-71
获得成果目录清单  71-73
致谢  73

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中图分类: > 工业技术 > 轻工业、手工业 > 食品工业 > 一般性问题 > 基础科学 > 食品微生物学
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