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当归提取物及佛手柑内酯对伏立康唑和伊曲康唑体外细胞转运的影响

作　者: 熊友健
导　师: 李焕德
学　校: 中南大学
专　业: 药剂学
关键词: 当归提取物 佛手柑内酯 伏立康唑 伊曲康唑 Caco-2细胞
分类号: R285
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


一、目的通过建立Caco-2细胞模型,预测和筛选与当归提取物及其呋喃香豆素类成分可能发生相互作用的药物；研究当归提取物及佛手柑内酯对伏立康唑(Voriconazole, VOR)和伊曲康唑(Itraconazole, ITR)体外细胞转运的影响。初步探讨当归提取物及佛手柑内酯与VOR和ITR发生的相互作用机制,为临床安全用药提供理论基础。二、方法1 Caco-2细胞单层模型的建立和确证为了研究当归提取物及佛手柑内酯对VOR和ITR体外细胞转运的影响,而采用Caco-2细胞培养的方法,建立体外Caco-2细胞单层模型。Caco-2鉴定采用细胞形态学、免疫荧光、荧光黄和普萘洛尔的通透性和跨膜电阻(TEER)的验证。2当归提取物及佛手柑内酯、VOR和ITR对Caco-2细胞毒性采用苯基溴化四氮唑蓝法(MTT)分别考察当归醇提物(Angelica sinensis alcohol extract, AE)、当归水提物(Angelica sinensis aqueous extract, AW)、佛手柑内酯(Bergapton, BGT)、VOR和ITR对Caco-2细胞的毒性,选择细胞存活率大于90%的药物浓度作为非细胞毒性剂量进行下一步细胞实验。3当归提取物及佛手柑内酯对VOR体外细胞转运的影响建立HPLC法测定转运和摄取实验中VOR的浓度,并进行方法学确证。在建立好的体外Caco-2细胞单层模型上,考察VOR的双向跨膜转运,比较不同的药物合用对VOR双向转运的差异,单用VOR作为对照组。HPLC测定样品中VOR的浓度,计算表观通透系数Papp和外排率ER。在常规培养的Caco-2细胞中考察细胞对VOR的摄取实验,比较不同的药物合用对VOR在Caco-2细胞上的摄取的差异,单用VOR作为对照组。HPLC测定样品中VOR的浓度。4当归提取物及佛手柑内酯对ITR体外细胞转运的影响建立HPLC法测定转运和摄取实验中ITR的浓度,并进行方法学确证。在建立好的体外Caco-2细胞单层模型上考察ITR的双向跨膜转运,比较不同的药物合用对ITR双向转运的差异,单用ITR作为对照组。HPLC测定样品中ITR的浓度,计算表观通透系数Papp和外排率ER。在常规培养的Caco-2细胞中考察细胞对ITR的摄取实验,比较不同的药物合用对ITR在Caco-2细胞上的摄取的差异,单用ITR作为对照组。HPLC测定样品中ITR的浓度。三、结果1 Caco-2细胞单层模型的建立和确证Caco-2细胞在正常条件下生长旺盛,通过对细胞形态、免疫荧光、荧光黄和普萘洛尔的通透性和跨膜电阻(TEER)的验证,均满足Caco-2细胞单层模型的要求。可用于研究当归提取物及其有效成分对VOR和ITR的相互作用。2当归提取物及佛手柑内酯、VOR和ITR对Caco-2细胞毒性24小时MTT毒性实验结果显示,AE、AW、BGT、VOR和ITR对Caco-2细胞的最大无毒浓度分别为250μg·mL-1,250μg·mL-1, 30μg·mL-1,40μg·mL-1和50μg·mL-1。分别选择20μg·mL-1ITR和VOR,5、20μg·mL-1BGT,100、200μg·mL-1AE和AW进行下一步研究。3当归提取物及佛手柑内酯对VOR体外细胞转运的影响VOR跨Caco-2细胞单层模型转运实验结果显示：与单用VOR对照组相比,VOR+AW组的外排率明显增大,VOR+AE组的外排率显著减小,而VOR+BGT则组无明显差异。以上4组的外排率ER=Pappba/Pappab≥1.71,提示VOR在转运过程中是主动转运的,可能受其他载体转运。VOR在Caco-2细胞中摄取实验结果显示：与单用VOR对照组相比,VOR+BGT和VOR+AE组对VOR在Caco-2细胞的摄取量无明显影响,VOR+AW组对VOR在Caco-2细胞的摄取量显著降低,两个剂量间也无明显差异。说明：在Caco-2细胞上,AW可显著降低VOR的摄取量,而BGT和AE无明显差异,且不受合用药物剂量的影响。4当归提取物及其有效成分对ITR体外细胞转运的影响ITR的转运实验结果显示：与单用ITR对照组相比,ITR+AW组的外排率明显增大；ITR+BGT组和ITR+AE组的外排率均明显减小,且抑制外排率：ITR+BGT组>ITR+AE组。BL->AP方向的表观渗透系数倍高于AP->BL方向,并且以上4组的外排率ER=Pappba/Pappab≥1.03,提示ITR在转运过程中是受载体转运的主动转运。ITR的摄取实验结果显示：与单用ITR对照组相比,ITR+BGT组对ITR在Caco-2细胞的摄取量显著增加,ITR+AW组对ITR在Caco-2细胞的摄取量显著降低,ITR+AE组对Caco-2细胞的摄取量无显著性差异；两个剂量间无明显差异。说明,在Caco-2细胞上,BGT可显著增加了ITR的摄取量,AW则显著降低了ITR的摄取量,而AE无明显差异,且不受合用药物剂量的影响。四、结论1.当归醇提物对伏立康唑和伊曲康唑的外排具有一定的抑制作用；2.当归水提物对伏立康唑和伊曲康唑的外排具有一定的诱导作用；3.佛手柑内酯对伊曲康唑的外排具有一定的抑制作用。

全文目录


摘要  4-7
ABSTRACT  7-11
目录  11-14
英文缩写词表  14-15
前言  15-17
第一部分 Caco-2细胞单层模型的建立和确证  17-23
  1 材料与方法  17-18
    1.1 仪器  17
    1.2 药品与试剂  17-18
  2 实验方法  18-20
    2.1 溶液的配制  18
    2.2 细胞培养  18
    2.3 Caco-2细胞单层模型的建立  18
    2.4 细胞形态和功能的评价  18-19
    2.5 Caco-2细胞单层模型的评价  19-20
  3 结果  20-22
    3.1 细胞形态学考察  20-21
    3.2 细胞P-gp表达考察  21
    3.3 Caco-2细胞单层模型的评价  21-22
  4 讨论  22-23
第二部分 当归提取物及其有效成分、伏立康唑和伊曲康唑对Caco-2细胞毒性的实验  23-27
  1 材料与方法  23-24
    1.1 仪器  23
    1.2 药品与试剂  23-24
  2 实验方法  24-25
    2.1 溶液的配制  24
    2.2 MTT实验  24-25
  3 结果  25
  4 讨论  25-27
第三部分 当归有效成分对伏立康唑体外细胞转运的影响  27-47
  第一章 HPLC测定转运和摄取实验中伏立康唑的浓度  27-35
    1 仪器和材料  27
      1.1 仪器  27
      1.2 药品与试剂  27
    2 实验方法  27-30
      2.1 标准溶液的配制  27-28
      2.2 HPLC的色谱条件  28
      2.3 样品处理  28
      2.4 方法学考察  28-30
    3 结果  30-34
      3.1 方法的专属性  30-31
      3.2 标准曲线  31
      3.3 回收率  31-32
      3.4 精密度  32-33
      3.5 稳定性  33-34
    4 讨论  34-35
  第二章 当归有效成分对伏立康唑在Caco-2细胞单层模型中双向转运的影响  35-42
    1 材料与仪器  35
      1.1 仪器  35
      1.2 药品与试剂  35
    2 实验方法  35-37
      2.1 溶液配制  35-36
      2.2 实验分组  36
      2.3 按照第一部分的方法建立体外Caco-2细胞单层模型并进行验证  36
      2.4 药物跨膜转运实验  36-37
      2.5 样品中伏立康唑浓度的测定  37
    3 数据处理  37
    4 结果  37-40
      4.1 伏立康唑在Caco-2细胞单层膜型上的双向转运  37-40
      4.2 实验前后TEER值的改变情况  40
    5 讨论  40-42
  第三章 当归有效成分对伏立康唑在Caco-2细胞摄取的影响  42-47
    1 材料与仪器  42
      1.1 仪器  42
      1.2 材料与试剂  42
    2 实验方法  42-43
      2.1 细胞培养  42
      2.2 细胞摄取实验方案  42
      2.3 HPLC分析  42-43
      2.4 数据处理  43
    3 结果  43-45
      3.1 时间对伏立康唑摄取的影响  43
      3.2 浓度对伏立康唑摄取的影响  43-44
      3.3 pH值对伏立康唑摄取的影响  44-45
      3.4 药物合用对伏立康唑摄取的影响  45
    4 讨论  45-47
第四部分 当归有效成分对伊曲康唑体外细胞转运的影响  47-65
  第一章 HPLC测定转运和摄取实验中伊曲康唑的浓度  47-55
    1 仪器和材料  47
      1.1 仪器  47
      1.2 药品与试剂  47
    2 实验方法  47-50
      2.1 标准溶液的配制  47
      2.2 HPLC的色谱条件  47-48
      2.3 样品处理  48
      2.4 方法学考察  48-50
    3 结果  50-53
      3.1 方法的专属性  50-51
      3.2 标准曲线  51
      3.3 回收率  51-52
      3.4 精密度  52-53
      3.5 稳定性  53
    4 讨论  53-55
  第二章 当归有效成分对伊曲康唑在Caco-2细胞单层模型中双向转运的影响  55-61
    1 材料与仪器  55
      1.1 仪器  55
      1.2 药品与试剂  55
    2 实验方法  55-56
      2.1 溶液配制  55-56
      2.2 实验分组  56
      2.3 按照第一部分的方法建立体外Caco-2细胞单层模型并进行验证  56
      2.4 药物跨膜转运实验  56
      2.5 样品中伊曲康唑的测定  56
    3 数据处理  56
    4 结果  56-59
      4.1 伊曲康唑在Caco-2细胞单层膜型上的双向转运  56-59
      4.2 实验前后TEER值的改变情况  59
    5 讨论  59-61
  第三章 当归有效成分对伊曲康唑在Caco-2细胞摄取的影响  61-65
    1 材料与仪器  61
      1.1 仪器  61
      1.2 材料与试剂  61
    2 实验方法  61-62
      2.1 细胞培养  61
      2.2 细胞摄取实验方案  61
      2.3 HPLC分析  61-62
      2.4 数据处理  62
    3 结果  62-64
      3.1 时间对伊曲康唑摄取的影响  62
      3.2 浓度对伊曲康唑摄取的影响  62-63
      3.3 pH值对伊曲康唑摄取的影响  63
      3.4 药物合用对伊曲康唑摄取的影响  63-64
    4 讨论  64-65
总结与展望  65-66
结论  66-67
参考文献  67-71
综述  71-84
  参考文献  79-84
致谢  84-85
攻读学位期间发表论文情况  85

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中图分类: > 医药、卫生 > 中国医学 > 中药学 > 中药药理学
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