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钙对花生生长发育及其幼胚基因表达的影响

作　者: 陈华
导　师: 庄伟建
学　校: 福建农林大学
专　业: 植物学
关键词: 花生胚胎 SSH文库全长文库基因表达钙
分类号: S565.201
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

花生是世界四大油料作物之一,中国是世界上花生生产和消费最多的国家。花生功能基因研究,种子是关键对象;花生胚胎早期发育是花生产量和品质形成的重要时期。南方沙质旱地土壤地区花生常因缺钙而严重空荚或不饱满,导致花生减产降质。为揭示花生胚发育的功能基因组,同时揭示缺钙使花生胚败育的分子机理,本研究在平潭县典型缺钙地,设足钙与缺钙处理使花生幼胚向可育与败育方向发展,在对缺、足钙条件下花生形态及相关生物学性状差异观察的基础上,分别构建了缺、足钙条件下花生早期胚正反向抑制消减杂交文库和混合全长cDNA文库。对全长cDNA文库进行了初步EST测序与基因注释和功能分类,并对缺钙花生早期胚SSH文库进行了初步筛选,对筛选的差异基因进行了半定量RT-PCR初步鉴定。主要研究结果如下。（1）于结荚期对缺、足钙条件下花生幼胚发育进行了剥胚观察,于收获期对缺、足钙条件下花生植株进行形态观察,并对相关生物学性状进行了考查。结果发现,缺钙条件下花生生长后期植株比足钙条件下更加旺盛,茎部呈现暗紫色,多数表现为空荚或者烂果;足钙花生因后期营养较多分配到荚果,表现地上部生长较差,但荚果饱满,饱果数多。对花生早期胚败育的分子机理与防治对策进行了探讨,为指导生产实践提供参考。（2）利用抑制消减杂交技术成功构建了缺、足钙条件下花生早期胚正反向抑制消减杂交文库,缺、足钙初级文库分别包含有1.2×10⁶和1.4×10⁶个克隆。所长出的菌落中分别有93.2%和91.2%为白色克隆,经菌落PCR鉴定,发现其中单一扩增条带的克隆分别约占85.3%和86.9%,片段大小集中分布在200⁸00bp之间。（3）利用SMART技术成功构建了缺、足钙花生早期胚混合全长cDNA文库。初级文库的滴度为1.867×10⁶cfu/ml,重组率为95.8%,插入片段分布于500bp-2000bp之间,扩增文库的滴度约为9.68×10¹¹ cfu/ml。从文库中随机挑选20个单克隆,进行两端测序,结果表明全长率为45%,文库质量符合标准要求。从文库中随机挑取298个单克隆进行5’端测序,共得到288条EST序列,平均片段大小为671bp,其中有46条EST在NCBI上没有找到同源序列,242条EST中,主要与大豆、截型苜蓿、花生、百脉根、拟南芥等植物同源,仅有21.9%的EST序列与NCBI非冗余核苷酸数据库中的已知功能基因有较高的同源性,未知功能的EST占78.1%,在已知功能的53条EST中,主要涉及蛋白质合成加工及储藏基因、代谢相关基因、抗病与防御相关基因、转录因子、细胞生长/分化相关基因、细胞结构相关基因等。（4）利用菌落杂交的方法,分别以地高辛标记的缺、足钙花生早期胚cDNA为探针,与缺钙花生早期胚抑制消减杂交文库进行菌落杂交,初步筛选到14个差异表达基因,并对SSHQ-1,SSHQ-12,SSHQ-13,SSHQ-14进行了初步RT-PCR鉴定。结果表明,基因SSHQ-1和SSHQ-12都在缺钙花生早期胚中表达,而在足钙花生早期胚中没有表达,SSHQ-13在缺钙花生早期胚中的表达量明显高于在足钙花生早期胚中的表达量,SSHQ-14在缺钙花生早期胚中有表达,但表达量低,而在足钙花生早期胚中仅有微量表达。由此可见,钙对花生早期胚的基因表达有重要的调控作用。以上鉴定结果有待于进一步验证。以上研究结果建立了花生早期胚胎发育的功能基因组学平台,初步揭示了钙调控花生胚发育的原因,为深入揭示花生地下结果性和胚发育的分子机理奠定了基础。

全文目录

摘要  8-10
Abstract  10-12
前言  12-14
第一章文献综述  14-39
  1 钙调控植物（含花生）形态生长发育的研究进展  14-19
    1.1 钙在植物细胞中的存在形式  14
    1.2 钙对植物生理代谢的影响  14-16
    1.3 钙对植物营养生长的影响  16
    1.4 钙对植物生殖生长的影响  16-18
    1.5 花生缺钙的生理症状  18
    1.6 钙在花生荚果发育中的作用  18-19
  2 钙信号系统调控植物生长发育的分子机理研究进展  19-23
    2.1 钙信号系统  19-20
    2.2 钙信号系统调控植物生长发育的分子机理研究进展  20-23
  3 植物胚胎发育的分子与细胞生物学机理研究  23-29
    3.1 植物胚胎发育过程概述  23-25
    3.2 植物胚胎发育的分子与细胞生物学机理研究进展  25-28
    3.3 植物胚胎败育研究进展  28-29
  4 植物差异表达基因克隆方法研究进展  29-35
    4.1 mRNA 差异显示  29-30
    4.2 代表性差异分析  30
    4.3 消减杂交法  30-31
    4.4 抑制消减杂交  31-33
    4.5 基因表达的序列分析  33-34
    4.6 基因芯片  34-35
  5 植物功能基因组学研究进展  35-38
    5.1 植物功能基因组学概述  35-36
    5.2 植物功能基因组学主要研究内容  36
    5.3 植物功能基因组学研究技术与方法  36-38
    5.4 植物功能基因组学研究现状与发展趋势  38
  6 本论文的研究内容及意义  38-39
第二章钙对花生生物性状的影响  39-46
  1 材料与方法  39
    1.1 实验材料  39
    1.2 试验方法  39
  2 缺、足钙条件下花生形态观察及相关生物学性状的考查  39-40
    2.1 花生形态观察  39
    2.2 花生相关生物学性状考查  39-40
  3 结果与分析  40-44
    3.1 缺钙对花生营养器官发育的影响  40-41
    3.2 缺钙对花生生殖器官发育的影响  41-42
    3.3 缺、足钙花生农艺性状的差异  42-44
  4 讨论  44-46
    4.1 缺钙导致花生胚胎早期败育的生态生理原因探讨  44-45
    4.2 花生胚胎早期败育的防治对策  45-46
第三章缺、足钙诱导的花生早期胚抑制消减杂交文库的构建与分析  46-61
  1 材料与方法  46-53
    1.1 材料  46-47
    1.2 方法  47-53
  2 结果与分析  53-60
    2.1 分别构建了缺、足钙处理幼胚的SSH 文库  53-56
    2.2 所构建文库的质量分析  56-60
  3 讨论  60-61
    3.1 抑制消减杂交的优缺点  60
    3.2 关于如何提高SSH 文库的质量  60-61
第四章缺、足钙花生早期胚混合全长CDNA 文库的构建与分析  61-82
  1 材料与方法  61-68
    1.1 材料  61-62
    1.2 方法  62-68
  2 结果与分析  68-80
    2.1 构建了缺、足钙处理花生幼胚的混合全长文库  68-70
    2.2 所构建全长文库的质量分析  70-80
  3 讨论  80-82
    3.1 关于RNA 提取及cDNA 合成与文库构建质量的关系  80
    3.2 SMART 技术构建全长cDNA 文库的优缺点  80-82
第五章缺、足钙诱导花生早期胚差异表达基因的初步鉴定  82-94
  1 材料与方法  82-86
    1.1 材料与试剂  82
    1.2 方法  82-86
  2 结果与分析  86-92
    2.1 缺足钙处理幼胚差异表达基因的初步分离及测序结果  86-90
    2.2 差异表达基因的表达分析  90-92
  3 讨论  92-94
    3.1 花生缺钙导致早期幼胚基因的差异表达  92
    3.2 花生胚败育相关基因的功能与胚发育的关系初析  92
    3.3 关于cDNA 文库筛选方法探讨  92-94
参考文献  94-102
缩写词表  102-103
附录I 测序峰图  103-106
附录II 用到的MARKER 电泳图  106-107
附录III 本实验所用质粒载体  107-108
致谢  108

钙对花生生长发育及其幼胚基因表达的影响

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