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青枯菌诱导的花生SSH文库构建及分析

作　者: 吕建伟
导　师: 姜慧芳
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 花生青枯菌 SSH文库 RT-PCR 基因克隆
分类号: S565.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 155次
引　用: 2次
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内容摘要

花生(Arachis hypogaea L.)是世界范围内广泛栽培和种植的经济作物,是发展中国家植物油脂和蛋白质的重要来源。青枯病是限制我国花生生产的主要细菌性病害,一般发病率在10-30%,严重时达50%以上,甚至绝收。过去30年来,我国在花生青枯病抗性遗传改良方面取得了很大进展,育成了一批抗病品种在生产上应用。但是,这些抗病品种的产量潜力较低,主要原因是抗源遗传基础狭窄,抗性与高产优质呈负相关,常规育种方法很难取得突破性进展。借助分子生物学技术,发掘新的抗病基因,将为花生的青枯病抗性育种在新形势下取得突破奠定基础。基于SSH(抑制差减杂交)文库构建的新基因发掘是一种大规模高通量的基因发掘方法,已在很多作物中成功应用,但在花生抗病基因发掘中的应用很少。本研究以抗病花生种质为材料,通过SSH文库构建,发掘出了一批抗病相关基因,获得了植物凝集素和ADP核糖基化因子基因全长。主要研究结果如下:(1)以抗病花生品种远杂9102和感病品种中花12为材料,采用水培方法培养花生植株材料。在花生生长至3-4叶龄时,通过伤根处理,并在不同接种时间下接种不同浓度的强致病青枯菌液,调查抗病和感病品种的青枯病发病差异,建立了花生实验室青枯病抗性鉴定接种技术,确定最适接种浓度为3.0×107 cfu/ ml,处理时间30分钟。(2)以抗病种质J4为材料,按上述建立的接种方法接种30分钟,分别于接种后0.5 h、2 h、4 h、6 h、12 h、24 h、48 h取样,提取花生根系RNA,采用抑制差减杂交方法(SSH)构建了富集青枯菌侵染诱导相关基因片段的差减文库,获得3072个克隆,文库重组率达到73%,插入片段大小在0.2kb-0.6kb之间。从SSH文库中随机挑取1036个克隆进行了测序,对可能来自同一基因的序列进行拼接,获得183条Unigene,序列分析结果表明其中的162条基因片段来自花生,其余的21条为条纹病毒的外壳蛋白编码基因。根据核苷酸以及推导的氨基酸序列的同源性比较,在来自花生的162条基因片段中,初步明确了58条基因的生物学功能,44条unigene分别涉及细胞结构、信号转导、抗病防御、转录相关等基本抗病反应过程。(3)根据序列的生物学信息分析,结合基因功能分析,选取14-3-3蛋白、谷氧还蛋白、植物血凝素、花生病程相关蛋白(PR-10)、RUB1结合酶、C3HC4型锌指蛋白和ADP核糖基化因子共7条基因设计引物,利用RT-qPCR检测基因在抗感病材料中的表达差异。结果表明,被选基因在抗病材料接种青枯菌后均上调表达,在感病材料中下调表达或表达高峰出现的时间相对较晚。(4)将lectin基因和arf基因的Contigs片段与全长cDNA文库序列(未测通)比对,挑取全长cDNA文库保存的质粒进行测序,获得了这两条基因的全长序列。花生lectin基因全长1069bp,编码280个氨基酸,与同属豆科植物的豇豆(ABQ32293)中氨基酸序列的同源性为89%,与花生LECTIN蛋白序列的同源性为96%。花生arf基因全长841bp,编码181个氨基酸,与苜蓿(AAR29293)、水稻(BAB90396)中氨基酸序列的同源性为98%,与鼠耳芥(EFH68844)中氨基酸序列的同源性为99%。

全文目录

摘要  5-6
Abstract  6-12
第一章综述  12-20
  1.1 国内外花生产业发展现状  12
  1.2 花生青枯病及防治  12-14
    1.2.1 青枯菌的种类及对花生的危害  12-13
    1.2.2 青枯菌在花生中的致病过程与分子机理  13
    1.2.3 青枯菌在植株体内的分布及植株-病原互作反应  13-14
    1.2.4 青枯病的防治  14
  1.3 花生青枯病抗性遗传改良研究进展  14-16
    1.3.1 抗病种质的发掘与创造  14-15
    1.3.2 我国花生抗青枯病遗传改良研究进展及存在问题  15-16
    1.3.3 花生青枯病抗性分子标记研究进展  16
  1.4 植物抗病基因分离技术及研究进展  16-19
    1.4.1 基于遗传作图的基因发掘与图位克隆  16-17
    1.4.2 基于抗病基因同源序列发掘新基因  17-18
    1.4.3 抑制差减杂交技术  18-19
  1.5 本研究的必要性及意义  19-20
    1.5.1 必要性  19
    1.5.2 意义  19-20
第二章花生水培接种鉴定青枯病抗性方法的建立  20-24
  2.1 材料及仪器  20
  2.2 方法和步骤  20-21
    2.2.1 材料准备和生长条件设置  20
    2.2.2 青枯菌的培养  20-21
    2.2.3 花生青枯菌接种处理  21
  2.3 结果与分析  21-24
第三章花生抗青枯病材料SSH 文库的构建  24-39
  3.1 材料、试剂及仪器  24
  3.2 接种  24
  3.3 SSH 文库构建步骤  24-30
    3.3.1 取材  24
    3.3.2 总RNA 提取  24-25
    3.3.3 mRNA 纯化  25
    3.3.4 cDNA 第一链的合成  25-26
    3.3.5 cDNA 第二链的合成  26
    3.3.6 cDNA 的酶切  26-27
    3.3.7 接头连接  27
    3.3.8 第一次差减杂交  27-28
    3.3.9 第二次差减杂交  28
    3.3.10 巢式PCR 扩增  28-29
    3.3.11 与载体连接  29
    3.3.12 连接产物转化  29
    3.3.13 差减文库插入片段的检测  29-30
    3.3.14 EST 测序及同源序列比对  30
  3.4 结果与分析  30-39
    3.4.1 总RNA 质量和纯化的mRNA 质量  30-32
    3.4.2 cDNA 合成和酶切质量  32
    3.4.3 差减效果  32-34
    3.4.4 差减产物克隆  34
    3.4.5 SSH 文库测序及生物信息学分析  34-39
第四章差异片段的RT-PCR 分析  39-44
  4.1 材料及试剂  39
  4.2 实验方法  39-41
  4.3 结果与分析  41-44
第五章花生lectin 和arf 基因全长克隆及测序  44-48
  5.1 材料、试剂及仪器  44
  5.2 方法  44-45
  5.3 结果与分析  45-48
    5.3.1 克隆片段检测  45-46
    5.3.2 测序及BLAST 比对分析  46-48
第六章讨论及结论  48-52
  6.1 讨论  48-50
    6.1.1 花生抗青枯病实验室接种鉴定方法的有效性和实用性  48
    6.1.2 基于 SSH 方法发掘植物新基因的优越性  48-49
    6.1.3 抗病相关基因在植物中的作用  49-50
  6.2 结论  50-52
参考文献  52-58
致谢  58-59
作者简历  59

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 花生
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