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硼替佐米对人骨髓增生异常综合征细胞株MUTZ-1作用的实验研究

作　者: 丁汀
导　师: 金洁
学　校: 浙江大学
专　业: 内科学
关键词: 硼替佐米 骨髓增生异常综合征 MUTZ-1细胞株 凋亡 Bcl-2家族
分类号: R551.3
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


目的:骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndrome,MDS）是一组异质性造血干细胞克隆性疾病。以骨髓病态造血为特征,进行性、难治性外周血红细胞、粒细胞及血小板减少为主要临床表现。尽管传统的对症支持、化学疗法、激素和细胞因子治疗,近年来出现的多种新型药物,如免疫调节剂和诱导分化剂等,能够缓解疾病,延长患者的生存期,但目前本病仍缺乏有效的根治方法,又具有向白血病转化的高风险,故近年WHO分型已将MDS归类为髓系造血系统恶性疾病。硼替佐米（Bortezomib,PS-341）是丙氨基酸硼酸衍生物的一种,为新型蛋白酶体抑制剂,因其独特的抗肿瘤机制,临床已经广泛用于多发性骨髓瘤和其他系统恶性肿瘤的治疗。但是目前国内外有关PS-341对MDS细胞的作用罕见报道。本实验旨在研究PS-341对人MDS细胞株MUTZ-1的作用并初步探讨可能的作用机制,为临床治疗提供实验依据。方法:1.采用MTT比色法检测PS-341对人MDS细胞株MUTZ-1体外生长的抑制作用。2.瑞氏-姬姆萨（Wright-Giemsa）染色,油镜下观察细胞形态。3.应用流式细胞仪,Annexin V和PI双染色,分析检测细胞凋亡。4.Western-blot方法检测PS-341对MUTZ-1细胞凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3蛋白表达的影响。5.Western-blot方法检测PS-341对MUTZ-1细胞Bcl-2家族蛋白Bcl-2,Mcl-1和Bax蛋白表达的影响。6.采用MTT比色法检测PS-341作用下,MUTZ-1细胞株对三氧化二砷的敏感性变化。结果:1.PS-341抑制MUTZ-1细胞的生长,呈浓度和时间依赖性:MTT比色法检测结果显示,0～160 ng/ml PS-341处理MUTZ-1细胞24小时、48小时、72小时,能够明显抑制MUTZ-1细胞增殖,各组间差异显著（P值均小于0.01）。且生长抑制率与药物作用浓度呈正相关（P＜0.01）。PS-341处理细胞24小时、48小时、72小时后,MUTZ-1的IC50分别各为56.1ng/ml;34.2ng/ml;24.3ng/ml。2.PS-341诱导MUTZ-1细胞凋亡,呈浓度依赖性:采用瑞氏-姬姆萨染色,油镜下观察PS-341作用前后MUTZ-1细胞形态学变化,结果显示,20～80ng/ml的PS-341处理24小时后,MUTZ-1细胞出现典型的凋亡形态学特征,如胞浆空泡化,细胞体积缩小,细胞核染色质凝聚、边缘化,形成新月型核或环形核,细胞核碎裂,凋亡小体形成等。以流式细胞分析技术研究了细胞DNA含量及磷脂酰丝氨酸（PS）转位。PI的DNA染色结果显示,0～80ng/ml的PS-341作用24小时,AnnexinV-PI双标记法结果显示:以PS-341不同浓度20ng/ml,40ng/ml,80ng/ml处理MUTZ-1细胞24小时,结果显示,0～80ng/ml的PS-341处理MUTZ-1细胞24小时,早期凋亡细胞百分数分别为:15.3%,21.8%,35.4%（空白对照组为2.3%）,晚期凋亡细胞百分数分别为:20.4%,30.3%,36.7%,早期细胞凋亡率与药物作用浓度呈正相关（r=0.986,P＜0.01）。3.PS-341诱导Caspase-3依赖型MDS细胞凋亡:20～80ng/mlPS-341作用MUTZ-1细胞12小时后,Caspase-3和PARP蛋白都出现明显的激活带,光密度扫描显示,Caspase-3和PARP蛋白激活带表达水平与PS-341作用浓度存在正相关。提示PS-341通过激活Caspase-3途径诱导MDS细胞凋亡。4.PS-341通过影响Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Mcl-1和Bax蛋白的表达诱导MDS细胞凋亡:20～80ng/ml PS-341作用MUTZ-1细胞12小时后,Bcl-2、Mcl-1表达水平显著下调,Bax表达水平上调,光密度扫描示,Bcl-2、Mcl-1的蛋白表达水平与PS-341作用浓度存在负相关,Bax蛋白表达水平与PS-341作用浓度呈正相关,提示PS-341可能通过改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的蛋白表达比例,促使细胞色素C等多种凋亡因子的释放,诱导MDS细胞凋亡。5.PS-341增强MUTZ-1细胞对三氧化二砷的敏感性:分别单独及联合以PS-341 0～80ng/ml,As2O3 0.25～2μmol/L处理MUTZ-1细胞24小时,MTT比色法测定抑制率。结果显示,在一定浓度范围内,PS-341与As2O3联用效果优于单用,且细胞抑制率与药物浓度呈正相关。小结:1.在体外,PS-341可直接抑制MDS细胞株MUTZ-1细胞的生长,并呈浓度和时间依赖性;2.20～80ng/ml PS-341处理一定时间后可明显诱导MUTZ-1细胞凋亡,并呈浓度依赖性;3.PS-341诱导Caspase-3依赖型MDS细胞凋亡,并呈浓度依赖性。4.PS-341能下调Bcl-2和Mcl-1蛋白的表达水平,同时上调Bax蛋白的表达水平,改变Bcl-2家族抗凋亡因子和促凋亡因子的表达比例,诱导细胞凋亡。5.PS-341能增强MUTZ-1细胞对三氧化二砷的敏感性,在一定浓度范围内与三氧化二砷有协同作用。

全文目录


致谢  4-5
摘要  5-8
Abstract  8-10
目次  10-11
1 引言  11-13
2 材料与方法  13-20
  2.1 仪器、材料和试剂  13-15
  2.2 实验方法  15-20
3 结果  20-30
  3.1 PS-341对MUTZ-1细胞的生长抑制作用  20-21
  3.2 PS-341诱导MUTZ-1细胞凋亡的检测  21-24
  3.3 PS-341对MUTZ-1细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白表达的影响  24-25
  3.4 PS-341对MUTZ-1细胞Bcl-2、Mcl-1、Bax蛋白水平的影响  25-27
  3.5 蛋白酶体抑制剂PS-341增强MUTZ-1细胞株对As_2O_3的敏感性  27-30
4 讨论  30-36
5 结论  36-37
参考文献  37-42
综述  42-53
作者简历及在学期间发表的文章  53

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中图分类: > 医药、卫生 > 内科学 > 血液及淋巴系疾病 > 造血系疾病 > 骨髓疾病
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