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目的:骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨量减少,骨的微观结构退化为特征的,致使骨的脆性增加而易发生骨折的一种全身性骨骼疾病。其严重的并发症是脆性骨折,其中最常见的骨折部位是髋部和脊椎。OP已经成为世界范围内公众健康问题,据统计,2000年全球骨质疏松骨折的发病例数为900万,且新增病例数(特别是髋部骨折例数)随年龄增长不断增加,值得注意的是,其中75%的髋部骨折发生在女性。女性一生当中发生髋部骨折的危险性大于乳腺癌、子宫内膜癌和卵巢癌的危险性的总和,这足以引起我们对绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoprosis,PMOP)的重视。自然绝经或人工绝经造成的雌激素缺乏是发生PMOP的主要原因,绝经诱导骨转换增强,骨吸收和骨形成偶联失衡,促进骨丢失。虽然目前机制尚未明确,但研究发现雌激素水平下降,与多种可促进破骨细胞形成、抑制破骨细胞凋亡的骨吸收因子合成增加相关。在骨组织中,环氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)由成骨细胞及破骨细胞前体细胞分泌,作为前列腺素(prostaglandin synthesis,PGS)合成的限速酶,通过调节成骨细胞中前列腺素E2(prostaglandin-E2 ,PGE2)的合成间接诱导破骨细胞形成和骨吸收,PGE2是强烈的骨吸收刺激因子,研究表明绝经后机体处于PGE2依赖的、以骨丢失为特征的促炎性反应状态。核因子(nuclear factor-kappa B,NF-κB)是一种多效性转录调节因子,可调节破骨细胞的生成、作用及凋亡。体外研究表明NF-κB可激活COX-2的转录,使其表达增加,刺激破骨细胞的分化,导致破骨细胞生成增多,骨吸收活动增强,推测在PMOP体内骨微环境中NF-κB通过调控COX-2的表达增加,导致PGE2合成增多是PMOP的发病机制之一,通过抑制NF-κB活性,调节COX-2的表达对PMOP可能起到预防作用。本实验以去卵巢大鼠建立PMOP模型,通过对去势大鼠给予选择性COX-2抑制剂—塞来昔布等干预因素,观察各组大鼠骨组织中NF-κB p65及COX-2的表达及其之间的相关性,了解塞来昔布对去卵巢大鼠骨丢失的影响及可能的作用机制,进而探讨PMOP发病机制以及为临床PMOP防治用药选择提供实验依据。方法:1动物分组和PMOP动物模型制备3月龄成年雌性Sprague/Dawley大鼠40只,随机分为4组,每组10只:①假手术(Sham)组、②卵巢切除(OVX)组、③卵巢切除+尼尔雌醇(OVX+E)组、④卵巢切除+塞来昔布(OVX+C)组。将大鼠以10%水合氯醛(100mg/kg)腹腔注射麻醉,无菌条件下,经腰背部正中纵行切口进入腹腔背侧,将②-④组大鼠切除双侧卵巢,①组大鼠切除双侧卵巢下方少许脂肪组织,重量约与卵巢相同。于去卵巢术后7天起,分别对各组大鼠进行灌胃给药,共12周。OVX+E组给予尼尔雌醇1.0mg·kg-1·w-1,OVX+C组给予塞来昔布4.0 mg·kg-1·d-1,Sham组及OVX组分别给予同体积0.9%氯化钠注射液,每日1次。给药剂量每周按体重校正1次。2双能X线吸收法确立PMOP动物模型于去势后12周,分别取各组大鼠置于Osteocore3型双能X线骨密仪上,通过计算机系统中心动物软件,测量每只大鼠双侧股骨骨密度(BMD),取平均值。BMD值用g/cm2表示。3苏木素-伊红(HE)染色及免疫组织化学染色动物处死后,立即无菌操作取左侧股骨下段,进行HE染色、免疫组织化学染色及观察。4结果判定与图像分析统计学分析实验结果应用SPSS13.0软件统计分析。所测数值均以均数±标准差(X-±S)表示,方差齐性检验采用Levene法,各组间变量比较采用完全随机的单因素方差分析,并采用SNK法进行两两比较;相关性分析用pearson积差相关分析。P<0.05被认为差异有统计学意义。结果:1试验前后各组大鼠体重变化比较实验前各组大鼠体重无明显差别。试验后与Sham组相比,OVX组及OVX+C组大鼠体重增加(P<0.05,P<0.05),OVX+E组大鼠体重差异无统计学意义(P>0.05);与OVX组相比,OVX+E组及OVX+C组大鼠体重下降(P<0.05,P<0.05);与OVX+E组相比,OVX+C组大鼠体重无明显差别(P>0.05)。2各组大鼠股骨BMD比较与Sham组相比,OVX组及OVX+C组大鼠BMD下降(P<0.05;P<0.05),OVX+E组大鼠BMD差异无统计学意义(P>0.05);与OVX组相比,OVX+E组及OVX+C组大鼠BMD亦增加(P<0.05;P<0.05);与OVX+E组相比,OVX+C组大鼠BMD无明显差别(P>0.05)。3骨组织学观察:与Sham组大鼠比较,OVX组大鼠骨皮质变薄,骨小梁稀疏或断裂,骨髓腔增宽,OVX+E组大鼠与Sham组相似,OVX+C组大鼠介于Sham与OVX组之间。4免疫组织化学染色观察NF-κB p65及COX-2蛋白阳性信号在四组大鼠骨组织中均有表达,NF-κB p65的阳性信号主要位于骨小梁周边成骨细胞、骨细胞中,骨髓基质细胞亦呈阳性染色,COX-2的阳性信号主要位于骨小梁周边成骨细胞中。5免疫组织化学染色结果与Sham组相比,OVX组及OVX+C组大鼠骨组织中NF-κB p65和COX-2阳性细胞染色灰度值增高(P<0.05,P<0.05)及(P<0.05,P<0.05),OVX+E组有增高去势,但差异无统计学意义(P>0.05,P>0.05);与OVX组相比,OVX+E组及OVX+C组大鼠大鼠骨组织中NF-κB p65和COX-2阳性细胞染色灰度值下降(P<0.05;P<0.05);与OVX+E组相比,OVX+C组大鼠大鼠骨组织中NF-κB p65和COX-2阳性细胞染色灰度值增高(P<0.05;P<0.05)。6相关性分析:OVX组及OVX+C组大鼠骨组织中,NF-κB p65表达与BMD呈负相关(r=-0.765 ,P <0.05)及(r=-0.807, P<0.05),COX-2表达与BMD呈负相关(r=-0.793 ,P <0.05)及(r=-0.712, P <0.05),NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平呈正相关(r=0.803 ,P <0.05)和(r=0.784 ,P <0.05),而Sham组及OVX+E组大鼠骨组织中,NF-κB p65和COX-2蛋白表达水平之间及与BMD间均无明显相关性。结论:1 PMOP模型建立;2 OVX导致大鼠体重增加,是机体阻止骨丢失的一种不完全代偿机制;3 NF-κB和COX-2在OVX所致骨丢失中起着重要的作用;4塞来昔布可预防OVX所致骨丢失;5塞来昔布预防OVX所致骨丢失可能是通过抑制NF-κB活性,调节COX-2的表达实现的。
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