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表面活性蛋白A、D在烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞炎症反应中作用的实验研究

作　者: 贾文妍
导　师: 赵桂秋
学　校: 青岛大学
专　业: 眼科学
关键词: 角膜上皮烟曲霉菌表面活性物质相关蛋白A 表面活性物质相关蛋白D 核因子-kB
分类号: R772.21
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：研究表面活性蛋白A、D(surfactant protein A and D,SP-A、SP-D)在烟曲霉菌(Aspergil lus fumigatus,A. fumigatus,AF)性角膜炎早期固有免疫应答阶段的表达变化和AF感染永生化人角膜上皮细胞(tolerated human corneal epithelial, THCEs)炎症反应中SP-A、SP-D的作用。方法：体外培养THCEs,自制烟曲霉菌孢子抗原刺激液,不同时间点0.5h、1h、2h、4h、6h和8h刺激各组THCEs(n=6)。以逆转录聚合酶链式反应(Reversed-transcript PCR, RT-PCR)检测THCEs中SP-A、SP-D mRNA的表达；以ELISA检测THCEs培养液上清中SP-A、SP-D的蛋白质表达水平、NF-kB的活化情况及下游Thl型细胞因子TNF-a、IL-1β和Th2型细胞因子IL-8、IL-10的变化。免疫细胞化学法检测THCEs中SP-A、SP-D的表达部位和表达强弱情况。结果：正常THCEs中有SP-A、SP-D mRNA和蛋白质的微量表达。烟曲霉菌孢子抗原以时间依赖方式促进THCEs中SP-A、SP-D的表达及细胞因子的分泌。(1)给予烟曲霉菌孢子抗原刺激0.5h后,SP-A、SP-D mRNA表达水平开始升高,分别为正常细胞组(对照组)的1.29倍和1.02倍(P<0.01); SP-A、SP-D mRNA表达水平2h达最高峰,分别为对照组的3.00倍和1.57倍(P<0.01)。(2)细胞上清SP-A、SP-D蛋白表达量在给予烟曲霉菌孢子抗原刺激0.5h后增多,分别为对照组的1.05倍和0.91倍(P<0.01),2h表达量最多,分别为对照组的1.48倍和1.92倍(P<0.01)。烟曲霉菌孢子抗原刺激后,NF-kB活化,并与SP-A、SP-D表达量呈负相关。烟曲霉菌孢子抗原刺激THCEs 1h组TNF-a、IL-1β表达开始增多,分别为对照组的1.82倍、1.43倍(P<0.05),刺激2h组表达量达最高峰,分别为对照组的2.80倍、2.86倍(P<0.01)。IL-8、IL-10在烟曲霉菌孢子抗原刺激1h组表达量开始升高,分别为对照组的1.12倍、1.28倍(P<0.05),表达量呈时间依赖方式逐渐升高。(3)免疫细胞化学检测发现,正常THCEs胞浆中有SP-A、SP-D的弱阳性表达,给予烟曲霉菌孢子抗原刺激0.5h开始阳性表达呈时间依赖性逐渐增强。结论：1、在烟曲霉菌感染早期阶段,SP-A和SP-D参与了THCEs对烟曲霉菌孢子抗原的识别。2、SP-A、SP-D在真菌性角膜炎固有免疫早期阶段发挥重要保护性作用,他们与炎性因子、免疫细胞共同构成了角膜抵御真菌的免疫防线。

全文目录

摘要  2-4
Abstract  4-7
引言  7-9
第1章材料与方法  9-18
  1.1 主要实验器材与试剂  9-11
    1.1.1 主要仪器与设备  9
    1.1.2 主要试剂  9-11
  1.2 实验方法  11-17
    1.2.1 烟曲霉菌抗原的制备  11-12
    1.2.2 永生化人角膜上皮细胞株(THCEs)的体外培养  12
    1.2.3 THCEs的烟曲霉菌孢子抗原刺激实验  12
    1.2.4 R-T PCR检测 SP-A、SP-D mRNA的表达  12-15
    1.2.5 ELISA实验  15-16
    1.2.6 免疫细胞化学法检SP-A、SP-D在THCEs中的表达  16-17
  1.3 统计学处理  17-18
第2章结果  18-24
  2.1 烟曲霉菌形态学观察  18
  2.2 THCEs形态学观察  18
  2.3 炎症信号通路活化实验  18-20
  2.4 ELISA检测结果  20-22
  2.5 免疫细胞化学染色结果  22-24
第3章讨论  24-29
结论  29-30
参考文献  30-32
附图  32-49
综述  49-60
  参考文献  58-60
攻读学位期间的研究成果  60-61
致谢  61-62

表面活性蛋白A、D在烟曲霉菌感染人角膜上皮细胞炎症反应中作用的实验研究

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