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三羟异黄酮对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究

作　者: 李轩
导　师: 谢立群
学　校: 河北医科大学
专　业: 内科学
关键词: 人结肠癌细胞 17β-雌二醇三羟异黄酮细胞增殖凋亡 caspase-3 bcl-2
分类号: R735.35
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

目的:本研究采用人结肠癌细胞LOVO为靶细胞,观察17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、三羟异黄酮(Genistein, GEN)对细胞增殖、凋亡的影响;检测三羟异黄酮作用细胞前后bcl-2、caspase-3基因表达的改变,探讨雌激素受体介导的细胞死亡特征和作用机制。方法: (1)MTT比色法检测17β-雌二醇、三羟异黄酮对细胞的生长抑制作用。(2)倒置光显微镜观察细胞形态结构改变;Hoechst33342/PI双荧光染色,荧光显微镜观察细胞死亡特征,区分凋亡细胞与坏死细胞。(3)流式细胞仪检测细胞凋亡峰及周期变化(4)半定量RT-PCR法检测LOVO细胞雌激素受体mRNA表达及三羟异黄酮对凋亡相关基因bcl-2、caspase-3基因表达的影响。结果: (1)MTT比色法检测三羟异黄酮及17β-雌二醇对LOVO细胞增殖的影响,其结果显示两种药物均可抑制LOVO细胞增殖,当作用时间相同时增殖抑制率与浓度正相关,呈浓度依赖性,当药物浓度相同时增殖抑制率与作用时间正相关,呈时间依赖性。30μmol /L三羟异黄酮即可对LOVO细胞起到一定的增殖抑制作用,高浓度三羟异黄酮(120μmol/L)对细胞有剧烈抑制作用,作用96小时后抑制率高达89.63%。低浓度的17β-雌二醇(10μmol/L)对LOVO细胞也有抑制作用,但与高浓度17β-雌二醇相比较其增殖抑制作用明显降低,其抑制作用也呈现时间依赖性。(2)细胞形态学改变:光学显微镜观察:倒置光显微镜下,对照组LOVO细胞细胞数目均增多、贴壁状况良好、细胞多呈梭形或多角形、大小适中铺满整个视野,核仁清晰、可见核分裂相;60μmol/L浓度的三羟异黄酮作用LOVO细胞48小时后与对照组比较细胞数目减少、贴壁状况不好,形态不规则、排列紊乱且有较多漂浮细胞,细胞出现不同程度的皱缩及空泡、核质比率倒置、核分裂相减少,细胞密度下降,细胞膜完整但出现发泡现象,细胞内可见多个折光性较强的圆形小泡样结构和细胞出芽样改变,细胞间失去正常接触抑制,细胞碎片增加、背景颗粒增多。60μmol/L浓度的17β-雌二醇处理细胞后,细胞停止增殖,细胞出现肿胀、变圆,呈较典型坏死征象。荧光显微镜观察:对照组LOVO细胞大小基本一致,被Hoechst33342大量的正常活细胞细被染成蓝色,胞膜完整,细胞核结构正常;少量的死亡细胞被染成红色,细胞核结构正常。相反60umol/L三羟异黄酮干预的LOVO细胞可见下列规律性的变化:作用24 h后部分细胞可见凋亡细胞被染成蓝色,染色质高度浓缩、边缘化,凝集成明亮的团块,即凋亡小体,部分细胞形态不规则,细胞变小,并有核碎裂现象;一些细胞被染成红色,但可见明显的染色质凝集,即凋亡后继发死亡的细胞。给予不同浓度的17β-雌二醇后未见以上凋亡细胞形态改变,经作用时间延长后可见部分细胞肿胀,被PI染成红色荧光,细胞呈坏死形态。(3)流式细胞仪检测结果:三羟异黄酮组细胞于作用后48小时较对照组细胞出现了明显的细胞凋亡,在正常二倍体细胞的G0-G1期前出现的亚二倍体峰即为凋亡峰AP;凋亡细胞百分比由3.16%增加至37.5%。17β-雌二醇干预细胞后,细胞周期发生变化,G2/M期细胞比例明显增加,但无凋亡峰出现。(4) RT-PCR法检测LOVO细胞雌激素受体mRNA表达及三羟异黄酮对凋亡相关基因bcl-2、caspase-3基因表达的影响:RT-PCR结果显示LOVO细胞中雌激素受体α表达微弱,而雌激素受体β呈强表达。三羟异黄酮对凋亡相关基因bcl-2、caspase-3 mRNA表达的影响:RT-PCR结果显示不同浓度三羟异黄酮处理LOVO细胞后,caspase-3表达较对照组增强,bcl-2表达呈浓度依赖性减弱。结论:(1)人结肠癌细胞系LOVO表达雌激素受体基因,但以雌激素受体β表达为主,雌激素受体α仅有微弱表达。(2)三羟异黄酮可明显抑制LOVO细胞的生长及增殖,抑制作用呈现浓度-时间依赖性。三羟异黄酮对LOVO细胞的抑制作用,其机制包括:抑制细胞增殖、诱导凋亡、改变细胞周期,影响凋亡相关基因caspase-3、Bcl-2的表达。(3)17β-雌二醇可明显抑制LOVO细胞的生长增殖,呈浓度-时间依赖性,但17β-雌二醇无诱导LOVO细胞凋亡的作用,其抑制作用可能与改变细胞周期有关。(4)三羟异黄酮与17β-雌二醇通过不同的作用机制抑制LOVO细胞的生长、增殖。三羟异黄酮的抗结肠癌机制可能通过非雌激素途径。

全文目录

中文摘要  4-7
英文摘要  7-11
研究论文三羟异黄酮对结肠癌细胞增殖及凋亡的影响及机制研究  11-53
  前言  11-13
  材料和方法  13-21
  结果  21-26
  附图  26-38
  附表  38-39
  讨论  39-46
  结论  46-47
  参考文献  47-53
综述雌激素与结肠癌关系的研究进展  53-67
致谢  67-68
个人简历  68

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