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沙冬青脱水素基因的克隆及对烟草的遗传转化

作　者: 乔慧蕾
导　师: 王瑞刚；郭九峰
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 脱水素克隆植物表达载体构建遗传转化
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
下　载: 103次
引　用: 2次
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内容摘要

本论文成功克隆了耐旱植物沙冬青中的脱水素基因,构建了植物表达载体并通过农杆菌介导法将其导入烟草中,获得了PCR检测阳性的转基因植株,为研究脱水素基因在转基因植物中的表达奠定基础。主要研究内容与结果如下:1、根据沙冬青脱水素基因cDNA序列设计特异引物,以沙冬青基因组DNA为模板进行特异性扩增,成功克隆了该脱水素基因。该基因全长1106bp,没有内含子,开放阅读框长552bp,5’UTR 98bp, 3’UTR 456bp,编码一条183个氨基酸的多肽。2、利用含有BstEⅡ和BglⅡ限制性内切酶位点的特异引物从重组的克隆载体中PCR获得目的片段,并将其定向插入到植物表达载体pCAMBIA3301的GUS表达区,获得重组表达载体pCAMBIA3301-DHN,通过冻融法将此表达载体导入农杆菌LBA4404中,提取转化质粒,经PCR鉴定表明脱水素基因植物表达载体构建成功。3、以烟草无菌苗叶片为转化受体材料,用携带脱水素基因的表达载体的根癌农杆菌进行叶盘转化,获得Kan抗性植株。提取转化植株总DNA,以重组表达载体为阳性对照,以非转基因植株为阴性对照,对转化植株进行PCR扩增,证明脱水素基因转到了烟草中。

全文目录

摘要  3-4
Abstract  4-8
1 引言  8-15
  1.1 脱水素的研究进展  8-15
    1.1.1 脱水素的性质特点  8
    1.1.2 脱水素的结构特征  8-9
    1.1.3 脱水素的分类  9-10
    1.1.4 脱水素的分布及组织、亚细胞定位  10-11
    1.1.5 脱水素在细胞内的运转  11
    1.1.6 脱水素的表达与调控  11-13
    1.1.7 脱水素的功能  13-15
  1.2 本项目研究目的、意义  15
2 沙冬青脱水素基因的克隆  15-24
  2.1 实验材料  15-16
    2.1.1 植物材料  15
    2.1.2 菌株和质粒  15
    2.1.3 主要试剂  15-16
    2.1.4 主要试剂配制  16
    2.1.5 培养基  16
  2.2 实验方法  16-20
    2.2.1 沙冬青基因组DNA 的提取  16-17
    2.2.2 脱水素基因扩增引物的设计  17
    2.2.3 目的片段的扩增  17-18
    2.2.4 PCR 产物的回收、纯化  18
    2.2.5 目的片段与克隆载体的连接  18
    2.2.6 大肠杆菌感感受态细胞的转化  18-19
    2.2.7 重组质粒的检测  19-20
  2.3 结果与分析  20-24
    2.3.1 脱水素基因的扩增  20
    2.3.2 目的基因的克隆及PCR 检测  20-22
    2.3.3 目的基因的序列测定  22
    2.3.4 沙冬青脱水素基因氨基酸序列的同源性比对  22-24
  2.4 讨论  24
3 脱水素基因植物表达载体的构建  24-30
  3.1 材料  24-25
    3.1.1 质粒与菌株  24
    3.1.2 酶及主要试剂  24
    3.1.3 培养基  24-25
  3.2 方法  25-28
    3.2.1 目的基因扩增引物的设计  25
    3.2.2 目的片段的PCR 扩增  25
    3.2.3 目的片段扩增产物的回收、纯化  25
    3.2.4 目的片段和表达载体的酶切及回收、纯化  25-26
    3.2.5 目的片段与载体大片段的连接  26
    3.2.6 连接产物的转化  26
    3.2.7 表达载体重组子的鉴定  26-27
    3.2.8 重组载体向农杆菌的导入  27
    3.2.9 农杆菌重组质粒的检测  27-28
  3.3 结果与分析  28-29
    3.3.1 目的片段的扩增及回收、纯化  28
    3.3.2 目的片段及载体的酶切  28-29
    3.3.3 目的小片段与载体大片段的连接转化  29
    3.3.4 表达载体重组子的PCR 鉴定  29
    3.3.5 重组载体向农杆菌的导入及检测  29
  3.4 讨论  29-30
4 脱水素基因对烟草的转化  30-35
  4.1 材料  30
  4.2 方法  30-32
    4.2.1 烟草外植体的准备  30
    4.2.2 侵染菌液的制备  30-31
    4.2.3 烟草叶盘的转化及其与农杆菌的共培养  31
    4.2.4 转化体的筛选和抗性小植株再生  31
    4.2.5 转基因植株的检测  31-32
  4.3 结果与分析  32-35
    4.3.1 烟草叶盘的转化及抗性植株的再生  32-34
    4.3.2 转基因植株的PCR 检测  34-35
  4.4 讨论  35
5 结论  35-36
致谢  36-37
参考文献  37-40
作者简介  40

沙冬青脱水素基因的克隆及对烟草的遗传转化

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