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两亲接枝共聚膦腈的纳米毒性的初步研究

作　者: 陈玥
导　师: 邱利焱
学　校: 浙江大学
专　业: 药物制剂
关键词: 两亲接枝聚膦腈聚乙二醇纳米毒理生物相容性凋亡 ROS
分类号: R943
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

两亲接枝聚膦腈共聚物作为药物缓控释载体材料,已在药物靶向治疗和抗肿瘤治疗领域呈现出良好的应用前景。本课题在聚膦腈分子主链上通过亲和取代反应引入了聚乙二醇亲水性的侧链,N,N-二异丙基乙二胺和丝氨酸甲酯的疏水性侧链,得到了新型的两亲接枝聚膦腈共聚物(PDS),聚合物的结构用FT-IR、1H表征,水溶液中自组装形成纳米粒后粒径在120nm-130nm范围内。考察聚合物纳米粒在血液中的生物相容性,包括血浆蛋白对聚合物纳米粒的吸附实验和巨噬细胞(THP-1)定量摄取实验。巨噬细胞对聚合物的吞噬作用受血浆蛋白调理作用的影响,聚合物材料由于聚乙二醇亲水链的空间排阻作用,血浆蛋白的粘附量减少,具备较强的抗调理吞噬的能力,实现了血液长循环的目的。比较了两种带不同电性的聚合物纳米粒的血浆蛋白吸附行为,实验结果表明,荷正电的纳米粒子在血液中更容易被单核巨噬细胞系统(MPS)消除。用荧光染料FITC标记两亲接枝聚膦腈共聚物(PDS),用采荧光分光光度法测定聚合物纳米粒在荷MCF-7裸鼠血浆和组织中的分布,实验结果表明聚合物材料在肿瘤部位有稳定的蓄积,在血液中的滞留时间较长,肝肾分布量较大。将正常人肝细胞(L-02)作为研究对象,考察聚合物材料对人体正常细胞的毒性作用和对细胞损伤机制的研究。采用激光共聚焦显微镜观察肝细胞对荧光标记材料的摄取和细胞内分布,结果说明摄取量与浓度呈正相关,材料分布在细胞浆,未入核。比较了含有裸露伯氨基-NH2的PDS-NH2和无裸露伯氨基的PDS-BOC对肝细胞毒性情况的异同：两种聚合物材料与肝细胞孵育24小时后,MTT实验和LDH含量测定结果表明,聚合物材料PDS-BOC和PDS-NH2只在高浓度时对肝细胞有一定毒性,PDS-NH2材料毒性比PDS-BOC稍大；由肝细胞凋亡／坏死率实验结果说明,两种聚合物材料PDS-BOC和PDS-NH2引起细胞凋亡程度轻微,细胞凋亡率呈现浓度相关性,在高浓度时引起的细胞凋亡率相对明显,高浓度的聚合物材料PDS-NH2除了诱发细胞凋亡,也诱发细胞坏死；说明伯氨基作为潜在的毒性基团,引起细胞膜和细胞器膜的损伤,增加了材料毒性。肝细胞与高浓度聚合物材料(0.5mg/ml)作用时,细胞内ROS水平升高、细胞线粒体膜电位下降、ATP含量下降以及凋亡蛋白Caspase3和Caspase9活性增加,由这一系列分析结果可以推断：聚合物材料诱导细胞凋亡是通过内源性即线粒体损伤通路进行的。将正常人肾细胞(HK-2)作为研究对象,考察聚合物材料PDS-BOC和PDS-NH2对肾细胞的毒性作用和对细胞损伤机制的研究。首先进行了MTT实验,LDH含量测定,再分别考察了细胞凋亡／坏死率,细胞ROS累积实验,细胞膜电位测定,ATP含量测定,Caspase活性检测这一系列实验,由这些实验结果判断,聚合物材料引起肾细胞毒性作用具有浓度依赖性,PDS-NH2材料毒性比PDS-BOC稍大,聚合物材料是通过内源性和外源性两条通路引发肾细胞的凋亡作用。

全文目录

致谢  4-5
摘要  5-7
ABSTRACT  7-10
目次  10-13
第一章引言  13-17
  1.1 医用纳米材料的体外生物相容性和纳米毒性研究  13-14
  1.2 两亲接枝聚膦腈的研究概况  14-15
  1.3 课题的提出  15-17
第二章两亲接枝聚膦腈纳米材料的合成与表征  17-23
  2.1 原料与仪器  17
    2.1.1 原料  17
    2.1.2 仪器  17
  2.2 实验方法  17-19
    2.2.1 聚乙二醇,N,N二异丙基乙二胺(DPA)和丝氨酸甲酯(SME)取代的两亲接枝聚膦腈的合成  17-19
    2.2.2 两亲接枝聚膦腈材料结构表征  19
    2.2.3 两亲接枝聚膦腈在水中粒径和Zeta电位测定  19
  2.3 结果与讨论  19-22
    2.3.1 两亲接枝聚膦腈结构表征  19-21
    2.3.2 两亲接枝聚膦腈在水中的粒径分布与电位  21-22
  2.4 小结  22-23
第三章两亲接枝聚膦腈胶束的体外生物相容性评价  23-33
  3.1 原料与仪器  23
    3.1.1 原料  23
    3.1.2 仪器  23
  3.2 实验方法  23-27
    3.2.1 聚合物对牛血清白蛋白(BSA)吸附量的测定  23-24
    3.2.2 异硫氰酸荧光素(FITC)标记PDS-NH_2  24-25
    3.2.3 聚合物对THP-1细胞和肝癌细胞存活率的影响  25-26
    3.2.4 THP-1细胞对聚合物材料吞噬行为的探讨  26-27
  3.3 结果与讨论  27-32
    3.3.1 聚合物对BSA(牛血清白蛋白)的吸附作用  27-28
    3.3.2 异硫氰酸荧光素(FITC)标记PDS-NH_2及标记效率  28-29
    3.3.3 聚合物对THP-1细胞和肝癌细胞存活率的影响  29-31
    3.3.4 THP-1细胞对聚合物PDS-NH_2-FITC的吞噬作用  31-32
  3.4 小结  32-33
第四章两亲接枝聚膦腈在荷MCF-7小鼠血浆和组织分布研究  33-41
  4.1 原料与仪器  33
    4.1.1 原料  33
    4.1.2 仪器  33
    4.1.3 实验动物  33
  4.2 实验方法  33-35
    4.2.1 裸鼠皮下移植MCF-7肿瘤模型的建立  33-34
    4.2.2 血浆及组织样品处理  34
    4.2.3 裸鼠血浆和组织聚合物含量测定的方法学考察  34-35
    4.2.4 PDS-NH_2-FITC在荷瘤裸鼠血浆和组织中的分布  35
  4.3 结果与讨论  35-40
    4.3.1 标准曲线与线性范围  35-36
    4.3.2 回收率与精密度  36-38
    4.3.3 PDS-NH_2-FITC在荷瘤裸鼠血浆和组织中的分布  38-40
  4.4 小结  40-41
第五章两亲接枝聚膦腈的肝细胞毒理学评价与毒性机制探讨  41-59
  5.1 原料与仪器  41-42
    5.1.1 原料  41
    5.1.2 仪器  41-42
  5.2 实验方法  42-46
    5.2.1 肝细胞对荧光标记聚合物的摄取  42
    5.2.2 聚合物对肝细胞的毒性评价  42-43
    5.2.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测  43-44
    5.2.4 肝细胞活性氧(ROS)水平测定  44
    5.2.5 肝细胞线粒体膜电位检测  44-45
    5.2.6 肝细胞ATP含量测定  45
    5.2.7 肝细胞凋亡蛋白Caspase活性检测  45-46
  5.3 结果与讨论  46-58
    5.3.1 肝细胞对荧光标记聚合物的摄取  46-48
    5.3.2 聚合物对肝细胞的毒性评价  48-50
    5.3.3 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测  50-51
    5.3.4 肝细胞活性氧水平测定  51-53
    5.3.5 肝细胞线粒体膜电位检测和ATP含量测定  53-56
    5.3.6 肝细胞凋亡蛋白Caspase活性检测  56-58
  5.4 小结  58-59
第六章两亲接枝聚膦腈的肾细胞毒理学评价与毒性机制探讨  59-73
  6.1 原料与仪器  59-60
    6.1.1 原料  59
    6.1.2 仪器  59-60
  6.2 实验方法  60-63
    6.2.1 聚合物对肾细胞的毒性评价  60-61
    6.2.2 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测  61
    6.2.3 肾细胞活性氧(ROS)水平测定  61-62
    6.2.4 肾细胞线粒体膜电位检测  62
    6.2.5 肾细胞ATP含量测定  62-63
    6.2.6 肾细胞凋亡蛋白Caspase活性检测  63
  6.3 结果与讨论  63-71
    6.3.1 聚合物对肾细胞的毒性评价  64-66
    6.3.2 Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测  66-67
    6.3.3 肾细胞活性氧水平测定  67-68
    6.3.4 肾细胞线粒体膜电位检测和ATP含量测定  68-70
    6.3.5 肾细胞凋亡蛋白Caspase活性检测  70-71
  6.4 小结  71-73
全文总结  73-76
参考文献  76-82
综述  82-96
  参考文献  90-96
作者简介  96
攻读学位期间的学位论文  96

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